Estudo dos efeitos morfológicos, comportamentais e epigenéticos da administração de doxorrubicina no período da infância de ratos Wistar, tratados ou não com resveratrol ou curcumina, e avaliados em idade adulta

As antraciclinas são potentes agentes quimioterápicos que revolucionaram o manejo do câncer infantil. Elas formam a base de uma série de protocolos terapêuticos usados para tratar tumores sólidos e hematológicos em crianças. Efeitos físicos e psicológicos adversos de longo prazo acompanham a sobrevivência de muitas das crianças curadas e submetidas a protocolos quimioterapêuticos e podem não se manifestar até a idade adulta, afetando diversos aspectos da função cognitiva, incluindo alterações de atenção, memória, velocidade de processamento, intelecto, desempenho acadêmico e saúde emocional. Objetivo: O presente estudo busca investigar a ocorrência da disfunção cognitiva em ratos adultos tratados com doxorrubicina (DOX) durante a infância, em associação ou não com o resveratrol (RSV), um polifenol natural que possui efeitos nootrópicos, ou com a curcumina (CUR), um pigmento amarelo extraído da Curcuma longa, que possui ação antioxidante e anti-inflamatória, analisando-se os possíveis efeitos morfológicos, comportamentais e epigenéticos de tais administrações. Métodos: Foram utilizados ratos Wistar machos, com duas semanas de idade, injetados com DOX (2,5 mg/kg, uma vez por semana, via intraperitoneal - IP, durante três semanas e 0,1 mL/kg/dia de água destilada por via oral - VO), em associação ou não com RSV (10 mg/kg/dia, durante o mesmo período, VO), ou com CUR (100 mg/kg/dia, durante o mesmo período, VO). Os animais do grupo controle receberam uma injeção semanal de solução fisiológica a 0,9% por via IP (mesmo volume) e água destilada diariamente (VO). Durante o período experimental, foram realizados estudos comportamentais, incluindo o teste de campo aberto, o teste de reconhecimento de novos objetos e o teste do labirinto de Barnes. Os encéfalos foram coletados e analisados pela técnica de coloração com hematoxilina-eosina e por imuno-histoquímica para a GFAP (glial fibrillary acidic protein) em astrócitos; para o marcador de micróglia Iba1 e para o marcador de apoptose caspase-3. As áreas analisadas incluíram o córtex frontal, o hipocampo (CA1, CA2 e CA3) e o hipotálamo. A análise morfométrica demonstrou que os ratos injetados com DOX apresentaram maior expressão de GFAP, Iba1 e caspase 3 em todas as áreas analisadas e que, tanto o RSV, quanto a CUR, foram capazes de diminuir tais expressões. A administração de DOX durante a infância foi capaz de causar prejuízos à memória espacial, e às memórias de curto e de longo prazo na vida adulta dos animais. Tais alterações foram prevenidas pela CUR, mas não pelo RSV. A DOX, em associação ou não com RSV e CUR, também demonstrou interferir, a longo prazo, na atividade de enzimas modificadoras da metilação (SET1A, SUV39, EZH2, KDM5B, KDM4A e KDM6B) e da acetilação de histonas (HAT1, SIRT1 e PCAF) na região do hipocampo destes animais. Os resultados sugerem que a astrogliose, a microgliose e a apoptose apresentadas na idade adulta estão relacionadas com o uso de DOX durante a infância e que o tratamento com RSV ou CUR foi capaz de minimizar tais alterações. No entanto, só a CUR demonstrou exercer efeito protetor em relação aos déficits de memória induzidos pela quimioterapia. Conclusão: Por fim, as alterações encontradas em importantes enzimas moduladoras da metilação e da acetilação de histonas na região do hipocampo sugerem que tais alterações morfológicas e comportamentais podem ser influenciadas por fatores epigenéticos e que o RSV e a CUR podem exercer ações protetivas aos danos tardios induzidos pela quimioterapia na infância.

Anthracyclines are potent chemotherapeutic agents that have revolutionized childhood cancer management. They form the backbone of a range of therapeutic treatments used to treat solid, hematologic tumors in children. Long-term adverse physical and psychological effects accompany cured children following chemotherapeutic protocols and may not manifest until adulthood, affecting several aspects of cognitive function, including changes in attention, memory, processing speed, intellect, performance academic and emotional health. The present study aims to investigate the occurrence of cognitive dysfunction in adult rats treated with doxorubicin (DOX) during childhood, in association or not with resveratrol (RSV), a natural polyphenol that has nootropic effects, or with curcumin (CUR), a yellow pigment extracted from Curcuma longa, which has antioxidant and anti-inflammatory actions, analyzing the morphological, behavioral, and epigenetic effects of such administrations. Two-week-old male Wistar rats injected with DOX (2.5 mg / kg, once a week, intraperitoneally - IP, for three weeks and 0.1 mL / kg / day of distilled water by oral - VO), in association or not with RSV (10 mg / kg / day, during the same period, VO), or with CUR (100 mg / kg / day, during the same period, VO). The animals in the control group received a weekly injection of 0.9% saline solution via IP (same volume) and daily distilled water (VO). During the experimental period, behavioral studies were carried out, including the open field test, the new object recognition test, and the Barnes maze test. The brains were collected and analyzed by the hematoxylin-eosin staining technique and by immunohistochemistry for GFAP (glial fibrilary acidic protein) in astrocytes; for the microglia marker Iba1 and for the apoptosis marker caspase-3. Areas investigated included the frontal cortex, the hippocampus (CA1, CA2 and CA3) and the hypothalamus. Morphometric analysis showed that rats injected with DOX presented increased expression of GFAP, Iba1 and caspase 3 in all areas and that both RSV and CUR were able to prevent such increases. The administration of DOX during childhood was able to impair spatial memory, and short- and long-term memories during adult life. Such deficits were prevented by CUR administration, but not with RSV. DOX, in association or not with RSV and CUR also affected, in the long term, the activity of methylation modifying enzymes (SET1A, SUV39, EZH2, KDM5B, KDM4A and KDM6B) and of acetylation enzymes (HAT, SIRT1 and PCAF) for histones in the hippocampus of these animals. The results suggest that astrogliosis, microgliosis and apoptosis in adulthood are related to the use of DOX during childhood and that treatment with RSV or CUR was able to minimize changes. However, only CUR presented a protective effect in relation to chemotherapy-induced memory deficits. Finally, changes found in important histone methylation and acetylation modulating enzymes in the hippocampus suggest that morphological and behavioral changes may be influenced by epigenetic factors and that RSV and CUR may exert preventive actions against late changes induced by childhood chemotherapy.

CHEMOBRAIN EM RATOS: ESTUDO DOS EFEITOS MORFOLÓGICOS, OXIDATIVOS, INFLAMATÓRIOS E COMPORTAMENTAIS DA ADMINISTRAÇÃO DO QUIMIOTERÁPICO DOXORRUBICINA

A doxorrubicina (DOX), um agente interativo da topoisomerase, é comumente utilizada no tratamento de vários tipos de câncer. Esta droga é conhecida por causar prejuízos cognitivos em indivíduos submetidos à quimioterapia de longo prazo (déficits também chamados de chemobrain). O presente estudo investigou se alterações morfológicas, oxidativas, inflamatórias e comportamentais poderiam ser induzidas por DOX. Ratos Wistar machos foram injetados com DOX (2,5 mg/kg, uma vez por semana, durante 28 dias, via intraperitoneal IP) ou solução fisiológica a 0,9% (mesmo volume, IP). Durante o período experimental, foram realizados estudos comportamentais, incluindo o teste de campo aberto, o de labirinto em cruz elevada, e os testes de preferência social e de reconhecimento de novo objeto (NORT). Os encéfalos foram coletados e analisados por técnicas de coloração com hematoxilina-eosina e luxol fast blue, bem como por imuno-histoquímica (GFAP expressão de glial fibrilary acidic protein em astrócitos) em diferentes áreas (córtex frontal, estriado, hipocampo, hipotálamo, camadas granular e molecular do cerebelo). Os parâmetros oxidativos foram também avaliados, tais como substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS), catalase (CAT), superóxido dismutase (SOD), glutationa peroxidase (GPx), glutationa redutase (GR), óxido nítrico (NO), ferro e ferritina encefálicos, assim como glutationa em seus estados reduzido (GSH) e oxidado (GSSG). Os níveis séricos e encefálicos de TNF-, IL-1, IL-6, IL-8, IL-10 e CXCL1 foram determinados por ELISA. A análise morfométrica mostrou que os ratos injetados com DOX apresentaram maior expressão de GFAP em todas as áreas analisadas. A administração de DOX também aumentou os níveis dos indicadores oxidativos TBARS, NO e GR, mas diminuiu os níveis encefálicos de GSSG e de ferritina, além de causar prejuízos de memória de reconhecimento, como visto no NORT. Não foram encontrados sinais de desmielinização e/ou perda neuronal. Níveis séricos e encefálicos aumentados de IL-6, IL-8 e CXCL1 foram observados no grupo DOX, embora a IL-10 tenha diminuído. Os resultados sugerem que a astrogliose e o estresse oxidativo induzidos pela DOX podem estar associados aos déficits de memória induzidos pela quimioterapia. Como a DOX possui uma pobre penetração por meio da barreira hematoencefálica, propõe-se que a entrada de citocinas séricas inflamatórias no encéfalo possa causar as mudanças encontradas em nosso estudo.

Doxorubicin (DOX), a topoisomerase interactive agent, is commonly used to treat several types of cancer. This drug is known to cause cognitive impairments in individuals submitted to long-term chemotherapy (deficits also called as chemobrain). The present study investigated whether morphological, oxidative, inflammation and behavioral impairments could be induced by DOX. Male Wistar rats were injected with DOX (2.5 mg/kg, once every week for 28 days, intraperitoneal route-IP) or 0.9% saline solution (same volume, IP). During the experimental period, behavioral studies were performed, including the open field test, the elevated plus maze, tests for social preference ande the novel object recognition task (NORT). Brains were collected and analyzed by hematoxylin-eosin and luxol fast blue staining techniques and by immunohistochemistry (GFAP- glial fibrillary acidic protein expression in astrocytes) in different areas (frontal cortex, striatum, hippocampus, hypothalamus, granular and molecular layers of the cerebellum). Oxidative parameters were also assessed, such as thiobarbituric acid reactive substances (TBARS), catalase (CAT), superoxide dismutase (SOD), glutathione peroxidase (GPx), glutathione reductase (GR), nitric oxide (NO), brain iron and ferritin levels, as well as glutathione in its reduced (GSH) and oxidized (GSSG) states. Serum and brain levels of TNF-, IL-1, IL-6, IL-8, IL-10 and CXCL1 were determined by ELISA. Morphometric analysis showed that DOX-injected rats presented increased GFAP expression in all analyzed areas. DOX administration also increased the levels of the oxidative indicators TBARS, NO and GR, but decreased GSSG and brain ferritin levels, and caused memory impairments as seen in the NORT. No signs of demyelination and/or neuronal loss were found. Increased serum and brain levels of IL-6, IL-8 and CXCL1 were noted in the DOX group, although IL-10 decreased. Results suggest that astrogliosis and oxidative stress induced by DOX may be linked to chemotherapy-induced memory deficits. As DOX has a poor penetration across the blood-brain barrier, it is proposed that the entry of serum inflammatory cytokines into the brain may cause the changes found in our study.