Participação das proteínas morfogenéticas ósseas no crescimento folicular final, ovulação e função luteal

Fatores produzidos no ovário, como os membros da família dos fatores de crescimento transformantes beta (TGF) e seus receptores, exercem papel essencial durante a divergência folicular e ovulação. Interações entre ligantes e seus receptores estão envolvidas em distintas funções ovarianas sob condições fisiológicas ou patológicas. Em especial os fatores produzidos pelos oócitos como a proteína morfogenética óssea 15 (BMP15) e o fator de crescimento e diferenciação 9 (GDF9), desempenham papéis importantes na regulação das funções ovarianas como crescimento e diferenciação folicular. Entretanto, grande parte do conhecimento sobre esses fatores tem sido obtido em modelos in vitro ou através da observação de mutações espontâneas em ovelhas e, apesar da grande relevância, a função destes na fisiologia ovariana ainda é pouco conhecida. Além disso, o papel do sistema TGF na modulação do processo de regressão do corpo lúteo ainda não foi investigado nas espécies domésticas. Neste contexto, esta tese apresenta uma série de estudos acerca da participação de membros da família TGF, em especial das BMPs, na regulação de eventos ovarianos envolvendo o crescimento folicular final, ovulação, formação do corpo lúteo e luteólise. O primeiro estudo trata-se de uma revisão que teve por objetivo reunir a informação disponível na literatura sobre o tema. Posteriormente, um segundo estudo objetivou investigar o nível de transcritos de membros da família TGF e seus receptores durante a luteólise induzida in vivo. Foram utilizadas amostras de corpos lúteos bovinos coletados in vivo nos momentos 0, 2, 12, 24 e 48 h após a administração de uma dose de PGF2 no dia 10 do ciclo estral. Os níveis de RNAm de BMP4, BMP6 e INHBA foram regulados positivamente às 2 h após a administração de PGF2 (P<0,05) em comparação com 0 h. A expressão relativa de RNAm de BMP2, BMP4, ACVR1B, INHBA e INHBB foi regulada positivamente 12 h após a aplicação de PGF2 (P<0,05), enquanto que o TGFBR3 teve uma regulação negativa às 48 h. Coletivamente os dados demonstram que os RNAm de membros da família TGF são regulados pelo tratamento com PGF2, sugerindo um envolvimento no processo de luteólise funcional e morfológica em bovinos. Em um terceiro estudo, objetivou-se determinar o efeito da injeção intrafolicular da BMP15 sobre o crescimento folicular final e ovulação/luteinização. Ainda, avaliou-se o efeito do tratamento com gonadotrofinas em células da granulosa cultivadas in vitro, sobre o nível de transcritos dos receptores da BMP15. Foi realizada a injeções intrafoliculares de BMP15rh nas concentrações de 100 ng/mL, em folículos dominantes, e de 500 ng/mL, em folículos pré-ovulatórios. Os resultados da injeção intrafolicular de BMP15rh demonstram uma tendência (P=0,09) de inibição do crescimento folicular. Já os resultados em folículos pré-ovulatórios suportam a hipótese de um efeito inibitório sobre o crescimento folicular e ovulação, sem inibir a luteinização. Folículos tratados com BMP15 não ovularam e deram origem a estruturas císticas luteinizadas, o que foi confirmado através de dosagens de progesterona sérica. No cultivo das células da granulosa in vitro, a expressão de RNAm de BMPR2 e BMPR1B não foi alterada pelo tratamento com LH ou FSH. Conclui-se que o tratamento com BMP15 inibe o desenvolvimento folicular e a ovulação, induzindo à luteinização e formação de cistos em bovinos. Estudos moleculares futuros são necessários para elucidar os mecanismos de ação da BMP15. Um quarto estudo foi conduzido com o objetivo de validar um método de coleta in vivo de células da granulosa bovinas, para estudos de expressão gênica. Foram testados seis protocolos distintos de separação das células após a coleta, buscando a forma mais adequada para a extração do RNA, sem interferência de outras células eventualmente presentes nas amostras. A partir dos resultados sugerese que o tratamento dos pellets celulares obtidos após aspiração folicular com tampão de lise de eritrócitos possibilita uma melhor qualidade de RNA. Com um protocolo adequado de processamento das células, pode-se dar continuidade à investigação dos efeitos dos fatores foliculares nas células da granulosa in vivo. Coletivamente, os estudos acima descritos, além da gerar conhecimento básico para compreensão do papel dos fatores locais na fisiologia ovariana, podem contribuir no entendimento de processos patológicos e no desenvolvimento de tecnologias que tenham por finalidade a contracepção ou aumento da taxa ovulatória.

Factors produced in the ovary, such as transforming growth factors beta members (TGF) and their receptors, play a key role during follicular deviation and ovulation. The interactions between ligands and receptors are involved in different ovarian functions under physiological or pathological conditions. In particular, factors produced by oocytes such as bone morphogenetic protein 15 (BMP15) and growth and differentiation factor 9 (GDF9) are involved in the regulation of ovarian functions such as follicular development and differentiation. However, most of the knowledge about these factors has been obtained using in vitro models or through spontaneous mutations in ewes and, despite the great relevance, little is known about the function of the oocyte factors in the ovarian physiology. In addition, the regulation and function of the TGF system in the regression process of the corpus luteum has not been evaluated in domestic species. In this regard, this thesis presents a series of studies about the involvement of TGF family members, specially BMPs, in the regulation of ovarian function including final follicular growth, ovulation, corpus luteum formation and luteolysis. The first study aimed to review the information available in the literature on the regulation and function of TGF family members in ovarian function. The objective of the second study was to investigate mRNA regulation of some TGF family ligands and their receptors during induced-luteolysis in vivo. Cows received an injection of prostaglandin F2 (PGF2) on day 10 of the estrous cycle and luteal samples were obtained at 0, 2, 12, 24 or 48 h after treatment. The mRNA levels of BMP4, BMP6 and INHBA were upregulated at 2 h after administration of PGF2 (P<0.05) in comparison to 0 h. The relative mRNA expression of BMP2, BMP4, ACVR1B, INHBA and INHBB was upregulated at 12 h post PGF2 (P<0.05), whereas TGFBR3 was downregulated at 48 h. Collectively, the findings demonstrate that mRNA encoding several TGF family members are regulated after PGF2 administration in a time-specific manner, which suggests that this system is involved in both functional and morphological luteolysis in cattle. The objective of the third study was to evaluate the effect of BMP15 intrafollicular treatment on final follicular growth, ovulation and luteinization in cattle. Furthermore, it was evaluated the effect of gonadotrophins treatment in granulosa cells in vitro on the levels of transcripts encoding BMP15 receptors. Intrafollicular injections of rhBMP15 were performed at concentrations of 100 ng/mL, in dominant follicles, and 500 ng/mL, in preovulatory follicles. The intrafollicular injection of rhBMP15 tended (P=0.09) to inhibit follicular growth, whereas the treatment of preovulatory follicles support the hypothesis of an inhibitory effect on follicular growth and ovulation, without inhibiting luteinization. Follicles treated with BMP15 did not ovulate and became luteinized cysts, which was confirmed by serum progesterone levels. The mRNA expression of BMPR2 and BMPR1B in granulosa cells in vitro was not altered by the treatment with LH or FSH. In conclusion, the treatment with BMP15 inhibits follicular development and ovulation, inducing luteinization and cysts formation in cattle. Future molecular studies are needed to elucidate the mechanism of action of BMP15. The fourth study was conducted to validate a technique for in vivo granulosa cells collection for gene expression studies. Six different protocols for granulosa cells isolation after follicular aspiration were evaluated aiming to identify the more appropriate procedure to extract RNA without the interference of other cells potentially present in the samples. The results suggest that the treatment of granulosa cells pellets with red blood cell lysis buffer, just after follicular aspiration, allows obtaining samples with higher RNA quality. With a well-validated protocol for cells isolation, it will be possible to continue the investigation of the function of follicular factors on granulosa cells in vivo. Taken together, the above-described studies besides generating basic knowledge to understand the role of local factors in ovarian physiology, may contribute to the understanding of pathological processes and to the development of technologies to promote contraception or to increase ovulation rate.

Função e regulação de membros da família TGF beta no crescimento folicular final e ovulação em bovinos

A foliculogênese antral culmina com a ovulação, sendo controlada primariamente por mecanismos endócrinos bem estabelecidos. Após a emergência folicular, em espécies monovulares, apenas um folículo é selecionado para continuar o desenvolvimento, enquanto que os demais entram em processo de atresia. Uma vez que todos os folículos encontram-se sob o mesmo ambiente endócrino, fica evidente que fatores produzidos no ovário são reguladores do crescimento e da diferenciação folicular. Neste contexto, destacam-se fatores pertencentes à superfamília dos fatores de crescimento transformantes beta (TGF-) e seus receptores. Apesar da grande relevância, a real função dos TGF- na fisiologia ovariana ainda é desconhecida. Desta forma, o presente estudo teve por objetivo avançar no entendimento da função e regulação de fatores locais no ovário bovino, avaliando a função do fator de crescimento e diferenciação 9 (GDF9) no crescimento folicular final. Além disso, testou-se a hipótese de que os membros da família TGF-, em especial as proteínas morfogenéticas ósseas (BMPs) e seus receptores, são regulados durante o processo de luteinização e ovulação em bovinos. A injeção intrafolicular de GDF9 nas concentrações finais de 100 ou 1000ng/mL não teve efeito sobre o crescimento folicular final, manifestação de estro e ovulação (P>0,05). Nas células da granulosa de folículos pré-ovulatórios (>12 mm), a expressão de RNAm das BMPs 1 e 4 não foi regulada pela aplicação i.m. de GnRH (hora 0), enquanto que a expressão de BMP2 aumentou significativamente 3 e 6 horas após (P<0,05). A expressão de RNAm dos receptores BMPR2 e TGFBR1 nas células da granulosa aumentou significativamente 12h após tratamento com GnRH. Os receptores BMPR1A e 1B foram mais expressos no momento do tratamento, diminuindo 3 e 6 h após, apresentando uma elevação às 12h, diminuindo novamente nas 24h. Houve uma correlação negativa entre a expressão dos receptores TGFBR1 (R2=0,46), BMPR1A (R2=0,5) e 1B (R2=0,5) e os níveis intrafoliculares de progesterona. Coletivamente, os dados sugerem que a elevação nos níveis de GDF9 em folículos diferenciados não altera o destino dos mesmos. A expressão da BMP2 sugere uma participação no processo de luteinização/ovulação enquanto que a expressão dos receptores sugere uma inibição no processo de luteinização. A elucidação do papel dos fatores locais na fisiologia ovariana pode contribuir com o entendimento de processos patológicos e no desenvolvimento de tecnologias que tenham por finalidade a contracepção ou o aumento da taxa ovulatória.

Antral follicle development culminates with ovulation, being mainly controlled by well-established endocrine mechanisms. After follicular emergence, in monovulatory species, only one follicle is selected to grow whereas all the others undergo atresia. During these processes, all the follicles are under the same endocrine environment, indicating the participation of locally produced factors in the regulation of follicular growth and differentiation. In this context, the involvement of transforming growth factors-beta (TGF-) family members and their receptors is highlighted. Despite their relevance, the real functions of TGF- proteins in ovarian physiology is still poorly understood. In this regard, the aim of this study was to gain insight into the function and regulation of ovarian factors, investigating the function of growth and differentiation factor 9 (GDF9) during dominant follicle growth. Furthermore, we tested the hypothesis that TGF- members, especially bone morphogenetic proteins (BMPs) and their receptors are regulated during luteinization and ovulation processes in cattle. The intrafollicular injection of GDF9 at final concentrations of 100 and 1000ng/mL did not affect follicular growth, estrus manifestation and ovulation (P>0.05). In granulosa cells from preovulatory follicles (>12mm), mRNA expression of BMPs 1 and 4 was not regulated after i.m. administration of GnRH (0h), while the BMP2 expression was significantly upregulated at 3 and 6h (P<0.05). The mRNA expression of BMPR2 and TGFBR1 in granulosa cells increased 12h after GnRH treatment (P<0.05). The receptors BMPR1A and 1B were more expressed at the moment of GnRH injection, decreasing at 3 and 6h, increasing at 12h and decreasing again at 24h. There was a negative correlation between mRNA expression of TGFBR1 (R2=0.46), BMPR1A (R2=0.5) and 1B (R2=0.5) and intrafollicular progesterone levels. Collectively, the results suggest that increasing the levels of GDF9 in differentiated follicles does not affect their fate. BMP2 expression pattern suggests an involvement in luteinization/ovulation processes, whereas the expression of TGF- receptors suggests an inhibitory action during luteinization. Elucidating the functions of local factors in ovarian physiology would allow to better understand pathological processes and the development of technologies aiming contraception or, paradoxally, increasing ovulation rates.