Aspectos epidemiológicos e moleculares de Ehrlichia canis em cães domiciliados em municípios com diferentes altitudes no estado do Rio de Janeiro

A Ehrlichiose Monocítica canina é uma das doenças mais frequentemente diagnosticadas na rotina da clínica veterinária de pequenos animais. O estudo objetivou analisar a epidemiologia e a variabilidade genética da sequência 16S rRNA de Ehrlichia canis em amostras de sangue cães domiciliados em municípios do estado do Rio de Janeiro com diferentes gradientes de altitude, pelo período de um ano. Um total de 456 amostras de sangue foram coletadas para análise epidemiológica e molecular. O DNA total foi extraído a partir sangue, utilizando o Kit de extração de DNA (DNeasy Blood & Tissue kit QIAGEN). As amostras de DNA foram submetidas a qPCR com alvo na sequência 16S rDNA, seguindo protocolo previamente descrito na literatura. Posteriormente foram realizadas duas reações de PCR convencional também descritas na literatura objetivando caracterizar a sequência 16S rRNA das amostras positivas. No modelo de regressão logística foi observada uma associação entre a frequência de cães positivos para E. canis e a altitude (p<0.002). Cães domiciliados nos municípios de baixa altitude demonstram 2,18 vezes mais chances de infecção por E. canis quando comparados com cães domiciliados em municípios de elevada altitude. As variáveis acesso a ambiente urbano, infestação por carrapatos Rhipicephalus sanguíneus s.l e cães com raça também foram associados à presença de DNA de E. Canis. As variáveis ambientais como altitude, área de acesso dos cães, infestação por carrapatos e cães com raça explicam 73% a ocorrência de E. canis em cães nas regiões estudadas. Esses resultados demonstram que a altitude exerce influência sobre os determinantes causais e a frequência da infecção por E. canis em cães nos municípios estudados, assim como características intrínsecas ao cão. Na análise filogenética todas as sequências se agruparam dentro do clado de E. canis. O que demonstra que a sequência 16S rRNA é um excelente marcador filogenético para classificações taxonômicas, no entanto por ser bastante conservado não é tão bom para avaliar diversidades genéticas. As sequencias provenientes das amostras coletadas no município de Teresópolis possuem maior variabilidade genética quando comparada com as sequência obtidas no município de Paracambi. É possível que essa diversidade se dê por condições ambientais que ainda precisam ser elucidadas.

Canine Monocytic Ehrlichiosis is one of the most frequently diagnosed diseases in the dogs routine veterinary care. The goal of this study was to analyze the epidemiology and the genetic variability of the 16S rRNA sequence of Ehrlichia canis in blood samples from dogs living in different counties of the Rio de Janeiro State with diverse altitude ranges during the period of one year. A total of 456 blood samples were collected to be epidemiology and molecularly analyzed. Total DNA was extracted from the blood, using a DNA Extraction Kit (DNeasy Blood & Tissue kit QIAGEN). DNA samples were subjected to qPCR aiming at the 16S rRNA sequence, following protocol as previously described in the literature. Afterwards, two conventional PCR reactions were run, as was also described in the literature, in the intent of characterizing the 16S Gene in positive samples. In the logistical regression model an association between E. canis positive dogs and higher altitudes (p<0.002) was observed. Dogs residing in low altitude counties have 2.18 times more chance of being infected by E. canis when compared to dogs residing in high altitude counties. The variables access to urban environment, infestation by Rhipicephalus sanguíneus s.l ticks and pure breed dogs were also associated with the presence of E. canis in the blood canine subjects. The environmental variables such as high altitude, access to urban environment, infestation by Rhipicephalus sanguíneus s.l ticks and pure breed dogs explain 73% of the occurrence of E. canis in dogs in the areas studied. These results show that the altitude has positive influence over causal factors and frequency of infection by E. canis in dogs of the studied area as well as the dogs intrinsic characteristics. In the phylogenetic analysis, all sequences obtained in this study were grouped in the E. canis clade. This demonstrates that the 16S rRNA sequence is an excellent phylogenetic marker for taxonomic classifications. However, due to its highly conservative characteristics its not as good for assessing genetic diversity. The 16S rRNA sequences obtained from samples collected in the Teresopolis municipality showed more genetic variations when compared to those collected in Paracambi municipality. It is possible that such diversity be a consequence of environmental conditions that need further elucidation.

Desenvolvimento de um RT-PCR RFLP para a detecção e diferenciação molecular das variantes vacinais e brasileiras do vírus da Bronquite infecciosa das Galinhas no Rio de Janeiro

A Bronquite Infecciosa das Galinhas (BIG), é uma doença causada por um vírus RNA de fita simples pertencente a Família coronaviridae, do gênero Gammacoranavirus.. A BIG é uma doença de alta importância econômica para a avicultura mundial, não só por causar prejuízos aos plantéis acometidos pela doença como também por ser diagnóstico diferencial de diversas patologias importantes na sanidade avícola. Os objetivos da presente pesquisa foi desenvolver uma técnica de RT-PCR RFLP capaz de detectar e discriminar com segurança as cepas do vBIG do sorotipo massachusetts e BR a partir de tecidos da traqueia, rim e intestino em granjas de frango de corte e postura no Estado do Rio de Janeiro. Neste estudo, foram coletadas 117 amostras de Intestino, rim e/ou traqueia de um total de 50 aves provenientes de 4 granjas (três granjas de corte e uma granja de postura) no estado do Rio de Janeiro. O RNA total foi extraído de todas as amostras e submetidos a uma reação de transcrição reversa, para realizar a síntese do cDNA. As amostras de cDNA foram submetidas a técnica de RT-qPCR. Constatou-se que 92% das aves (n = 46/50) foram positivas em pelo menos um dos órgãos para o vírus da bronquite das galinhas (vBIG). A técnica de RT-PCR RFLP desenvolvido por esse trabalho foi capaz de detectar uma frequência de 94,64% (n = 53/56) das amostras pertencentes ao sorotipo BR-I, 3,57% (n = 2/56) das amostras apresentaram fragmentos com padrão semelhante ao esperado do Sorotipo massachusetts e 1,78%(1/56) apresentou padrão para ambos os sorotipos (Massachusettsachusetts e BR). Não houve diferença significativa entre a frequência da detecção molecular do vBIG nos tecidos da traquéia, rim e intestino de frangos de corte e galinhas de postura de granjas no estado do Rio de Janeiro. A técnica de RT-PCR RFLP foi capaz de detectar e diferenciar com segurança os sorotipos massachusetts e BR.A alta frequência do sorotipo BR demonstra que apesar de vacinadas, as aves desenvolveram a doença, sugerindo, que um novo protocolo vacinal deva ser abordado, já que a maioria das cepas encontradas pertencem a um sorotipo geneticamente distinto.

The avian infectious bronchitis (AIB) is a disease caused by a single-stranded RNA virus pertaining to the coronaviridae family of the Gammacoranavirus genera. AIB is a disease of great economic significance to aviculture worldwide, not only because of the injury it causes to the breeders, but also because it is a differential diagnosis for several important pathologies that may affect poultry. The goals of the present research were to develop a RT-PCR RFLP technique capable of safely detecting and discriminating the strains of the IBV of themassachusetts and BR serotypes from the trachea, kidney and intestines issues in poultry farms of broilers and layers in the estate of Rio de Janeiro. In this study, 117 samples of intestines, kidneys and/or tracheae were collected from a total of 50 birds originating from 4 farms (three broiler farms and one layer farm) in the estate of Rio de Janeiro. The total RNA was extracted from all the samples and subjected to a reverse transcription process for the cDNA synthesis. The cDNA samples were subjected to the RT-qPCR technique. It was found that 92% of the birds (n= 46/50) were positive in at least one of the organs for the chicken bronchitis virus (vBIG). The RT-PCR RFLP techinique developed in this work was able to detect a frequency of 94,64% (n= 53/56) of the samples belonging to the BR-I serotype, 3,7% (n= 2/56) of the samples showed fragments with patterns similar to what is expected from themassachusetts Serotype and 1,78% (n= 1/56) showed patterns from both serotypes (Massachusettsachusetts and BR). There was no significant difference in the frequency of molecular detection of vBIG in the tissues of the trachea, kidney and intestines of the broiler and layer poultries from farms in the estate of Rio de Janeiro. The RT-PCR RFLP technique was able to safely detect and distinguish themassachusetts and BR serotypes. The high frequency of the BR serotype demonstrates that, although vaccinated, the birds developed the disease, indicating that a new vaccine protocol must be addressed, since the majority of the strains found belong to a genetically distinct serotype.