CLASSIFICAÇÃO FILOGENÉTICA E CARACTERIZAÇÃO GENOTÍPICA DOS ISOLADOS DE Escherichia coli PATOGÊNICA AVIÁRIA (APEC) PROVENIENTES DE GALINHAS CAIPIRAS

A Escherichia coli patogênica aviária (APEC) é incriminada por uma variedade de doenças extra-intestinais em aves, que podem causar tanto infecções localizadas, quanto generalizadas denominadas colibacilose. Os mecanismos de virulência têm sido continuamente estudados e considerados multifatoriais, assim sendo, o conhecimento da genética bacteriana capaz de gerar tais mecanismos, pode auxiliar na identificação de cepas patogênicas isoladas de aves. O presente trabalho foi delineado com o objetivo de investigar a distribuição de 17 genes de virulência em 72 cepas isoladas de galinhas caipiras pela PCR-multiplex e classificar-las nos grupos filogenéticos A, B1, B2 e D pela detecção de três marcadores de patogenicidade: chuA, yjaA e um fragmento anônimo de DNA designado TSPE4.C2. Todos os isolados apresentaram os genes iss (resistência sérica), ompT (protease de membrana externa) e hlyF (hemolisina F). A freqüência dos demais genes foi 66,7% cvaC, 87,5% iroN, 88,9% iutA, 88,9% sitA, 29,2% tsh, 58,3% iucC, 83,3% traT, 72,2% iucD, 81,9% fimH, 38,9% fyuA, 77,8% irp2, 16,7% vat, 15,3% astA e 1,4% papC. A análise filogenética revelou que a maioria dos isolados pertence ao grupo filogenético B2 (39/72), seguido pelo grupo A (17/72), grupo B1 (14/72) e grupo D (2/72). Os isolados dos grupos filogenéticos B2 e D estiveram associados a um maior número de genes de virulência, apresentando

Produção da nucleoproteína recombinante do vírus da influenza aviária para aplicação no imunodiagnóstico

A nucleoproteína (NP) do Vírus da Influenza Aviária (VIA) é um importante alvo antigênico no imunodiagnóstico desta doença, devido à sua baixa variabilidade entre as diferentes estirpes virais, resultando em uma elevada reatividade cruzada, e por ser também uma proteína altamente imunogênica para hospedeiros vertebrados. O objetivo deste estudo foi clonar parcialmente o gene codificador da NP do VIA e expressar em Escherichia coli como uma proteína recombinante fusionada ao polipeptídeo SUMO e uma etiqueta de poli-histidina, a fim de utilizá-la no desenvolvimento de um ensaio de ELISA indireto para a detecção de anticorpos específicos contra o VIA. O subtipo H4N6 do VIA tipo A foi propagado em ovos embrionados livres de patógenos e o RNA viral foi extraído. Após a Reação de Transcrição Reversa seguida pela Reação em Cadeia pela Polimerase (RT-PCR), foi obtido o material gênico a ser inserido no vetor pET SUMO (Invitrogen®) para posterior transformação em células de E. coli competentes. Foi realizada uma cinética da indução da expressão da NP recombinante (NPr), seguida da caracterização imunoquímica através das técnicas de PAGE-SDS e de Western Blotting, como também análise in silico dos principais sítios de antigenicidade. A NPr foi expressa na fração solúvel e facilmente purificada, sendo utilizada como uma preparação antigênica no ELISA indireto para detecção de anticorpos c

Imunidade induzida pela uso combinado de vacina atenuada (estirpe massachusetts) e vacina inativada experimental (variante br-i) contra o desafio com estirpe variante brasileira do vírus da bronquite infecciosa aviária

Há atualmente no Brasil, uma predominância de infecções causadas por estirpes do VBI classificadas no genótipo variante (BR-I), que revelam diferenças marcantes de antigenicidade com relação à estirpe vacinal Massachusetts, rotineiramente usada em nosso país. Isso resulta em uma baixa imunidade-cruzada e consequentemente em um menor nível de proteção contra isolados desse genótipo. O propósito deste trabalho foi testar uma vacina inativada contendo uma estirpe variante do VBI pertencente ao genótipo BR-I, e avaliar o estado de proteção induzido por esta vacina em combinação com a vacina atenuada Massachusetts em aves desafiadas com estirpe homóloga. Foram testadas aves SPF distribuídas em três grupos: grupo A (aves vacinadas ao 1º dia de idade com vacina atenuada comercial, revacinadas com 14 dias de idade com vacina inativada experimental e desafiadas aos 35 dias de idade); grupo B (aves não vacinadas e desafiadas aos 35 dias de idade); grupo C (controle). As aves de cada grupo foram sacrificadas aos 3, 7 e 11 dias pós-infecção, para colheita de amostras de traquéia, rins, soro e lágrima, e posteriormente avaliação histopatológica e das respostas imunes humoral(RIH) pelo ELISA e celular(RIC) pela expressão de genes de RIC. Os resultados deste estudo demonstraram que esse esquema imunoprofilático induziu aumentos significativos nos níveis de anticorpos lacrimais e séricos do i

Nanopartículas de quitosana para encapsular o vírus da bronquite infecciosa aviária (vbi)

Em busca de adjuvantes de nova geração para uso na formulação de vacinas contra patógenos virais, o trabalho teve como objetivo preparar nanopartículas de quitosana para encapsular o VBI. Foi utilizado uma suspensão da estirpe H120 atenuada do VBI em líquido córion-alantóide (LCA) para a formulação das nanopartículas por meio da técnica de gelificação iônica. Foram testadas diferentes concentrações de quitosana, ácido acético e tripolifosfato de sódio (TPP) e em diferentes condições de pH. Para o preparo das nanopartículas, um volume da suspensão viral em LCA foi adicionado a 10 volumes da solução de quitosana previamente preparada e, a essa mistura depois de agitada, foram adicionados 5 volumes de TPP, deixando-se essa mistura sob agitação por mais 10 minutos. As nanopartículas foram separadas por duas centrifugações seguidas, sendo armazenado o sobrenadante enquanto que o precipitado, contendo as nanopartcículas foi ressuspendido em PBS. O tamanho das nanopartículas foi medido no aparelho Zetasizer e a eficiência do encapsulamento foi avaliada pela dosagem de proteína presente no sobrenandante através da técnica de Bradford e pela detecção do RNA genômico viral por RT-PCR. Os resultados demonstraram que as concentrações de quitosana e TPP e o pH influenciaram na geração das nanopartículas, sendo que a melhor formulação foi obtida com a quitosana a 0,2%, o TPP a 0,2% e em p

CLASSIFICAÇÃO FILOGENÉTICA E CARACTERIZAÇÃO GENOTÍPICA DOS ISOLADOS DE Escherichia coli PATOGÊNICA AVIÁRIA (APEC) PROVENIENTES DE GALINHAS CAIPIRAS

A Escherichia coli patogênica aviária (APEC) é incriminada por uma variedade de doenças extra-intestinais em aves, que podem causar tanto infecções localizadas, quanto generalizadas denominadas colibacilose. Os mecanismos de virulência têm sido continuamente estudados e considerados multifatoriais, assim sendo, o conhecimento da genética bacteriana capaz de gerar tais mecanismos, pode auxiliar na identificação de cepas patogênicas isoladas de aves. O presente trabalho foi delineado com o objetivo de investigar a distribuição de 17 genes de virulência em 72 cepas isoladas de galinhas caipiras pela PCR-multiplex e classificar-las nos grupos filogenéticos A, B1, B2 e D pela detecção de três marcadores de patogenicidade: chuA, yjaA e um fragmento anônimo de DNA designado TSPE4.C2. Todos os isolados apresentaram os genes iss (resistência sérica), ompT (protease de membrana externa) e hlyF (hemolisina F). A freqüência dos demais genes foi 66,7% cvaC, 87,5% iroN, 88,9% iutA, 88,9% sitA, 29,2% tsh, 58,3% iucC, 83,3% traT, 72,2% iucD, 81,9% fimH, 38,9% fyuA, 77,8% irp2, 16,7% vat, 15,3% astA e 1,4% papC. A análise filogenética revelou que a maioria dos isolados pertence ao grupo filogenético B2 (39/72), seguido pelo grupo A (17/72), grupo B1 (14/72) e grupo D (2/72). Os isolados dos grupos filogenéticos B2 e D estiveram associados a um maior número de genes de virulência, apresentando

IMUNIDADE INDUZIDA PELA USO COMBINADO DE VACINA ATENUADA (ESTIRPE MASSACHUSETTS) E VACINA INATIVADA EXPERIMENTAL (VARIANTE BR-I) CONTRA O DESAFIO COM ESTIRPE VARIANTE BRASILEIRA DO VÍRUS DA BRONQUITE INFECCIOSA AVIÁRIA

Há atualmente no Brasil, uma predominância de infecções causadas por estirpes do VBI classificadas no genótipo variante (BR-I), que revelam diferenças marcantes de antigenicidade com relação à estirpe vacinal Massachusetts, rotineiramente usada em nosso país. Isso resulta em uma baixa imunidade-cruzada e consequentemente em um menor nível de proteção contra isolados desse genótipo. O propósito deste trabalho foi testar uma vacina inativada contendo uma estirpe variante do VBI pertencente ao genótipo BR-I, e avaliar o estado de proteção induzido por esta vacina em combinação com a vacina atenuada Massachusetts em aves desafiadas com estirpe homóloga. Foram testadas aves SPF distribuídas em três grupos: grupo A (aves vacinadas ao 1º dia de idade com vacina atenuada comercial, revacinadas com 14 dias de idade com vacina inativada experimental e desafiadas aos 35 dias de idade); grupo B (aves não vacinadas e desafiadas aos 35 dias de idade); grupo C (controle). As aves de cada grupo foram sacrificadas aos 3, 7 e 11 dias pós-infecção, para colheita de amostras de traquéia, rins, soro e lágrima, e posteriormente avaliação histopatológica e das respostas imunes humoral(RIH) pelo ELISA e celular(RIC) pela expressão de genes de RIC. Os resultados deste estudo demonstraram que esse esquema imunoprofilático induziu aumentos significativos nos níveis de anticorpos lacrimais e séricos do i

PRODUÇÃO DA NUCLEOPROTEÍNA RECOMBINANTE DO VÍRUS DA INFLUENZA AVIÁRIA PARA APLICAÇÃO NO IMUNODIAGNÓSTICO

A nucleoproteína (NP) do Vírus da Influenza Aviária (VIA) é um importante alvo antigênico no imunodiagnóstico desta doença, devido à sua baixa variabilidade entre as diferentes estirpes virais, resultando em uma elevada reatividade cruzada, e por ser também uma proteína altamente imunogênica para hospedeiros vertebrados. O objetivo deste estudo foi clonar parcialmente o gene codificador da NP do VIA e expressar em Escherichia coli como uma proteína recombinante fusionada ao polipeptídeo SUMO e uma etiqueta de poli-histidina, a fim de utilizá-la no desenvolvimento de um ensaio de ELISA indireto para a detecção de anticorpos específicos contra o VIA. O subtipo H4N6 do VIA tipo A foi propagado em ovos embrionados livres de patógenos e o RNA viral foi extraído. Após a Reação de Transcrição Reversa seguida pela Reação em Cadeia pela Polimerase (RT-PCR), foi obtido o material gênico a ser inserido no vetor pET SUMO (Invitrogen®) para posterior transformação em células de E. coli competentes. Foi realizada uma cinética da indução da expressão da NP recombinante (NPr), seguida da caracterização imunoquímica através das técnicas de PAGE-SDS e de Western Blotting, como também análise in silico dos principais sítios de antigenicidade. A NPr foi expressa na fração solúvel e facilmente purificada, sendo utilizada como uma preparação antigênica no ELISA indireto para detecção de anticorpos c

NANOPARTÍCULAS DE QUITOSANA PARA ENCAPSULAR O VÍRUS DA BRONQUITE INFECCIOSA AVIÁRIA (VBI)

Em busca de adjuvantes de nova geração para uso na formulação de vacinas contra patógenos virais, o trabalho teve como objetivo preparar nanopartículas de quitosana para encapsular o VBI. Foi utilizado uma suspensão da estirpe H120 atenuada do VBI em líquido córion-alantóide (LCA) para a formulação das nanopartículas por meio da técnica de gelificação iônica. Foram testadas diferentes concentrações de quitosana, ácido acético e tripolifosfato de sódio (TPP) e em diferentes condições de pH. Para o preparo das nanopartículas, um volume da suspensão viral em LCA foi adicionado a 10 volumes da solução de quitosana previamente preparada e, a essa mistura depois de agitada, foram adicionados 5 volumes de TPP, deixando-se essa mistura sob agitação por mais 10 minutos. As nanopartículas foram separadas por duas centrifugações seguidas, sendo armazenado o sobrenadante enquanto que o precipitado, contendo as nanopartcículas foi ressuspendido em PBS. O tamanho das nanopartículas foi medido no aparelho Zetasizer e a eficiência do encapsulamento foi avaliada pela dosagem de proteína presente no sobrenandante através da técnica de Bradford e pela detecção do RNA genômico viral por RT-PCR. Os resultados demonstraram que as concentrações de quitosana e TPP e o pH influenciaram na geração das nanopartículas, sendo que a melhor formulação foi obtida com a quitosana a 0,2%, o TPP a 0,2% e em p