Efeito da suplementação de metionina na forma livre e dipeptideo sobre a eficiência produtiva e regulação da expressão gênica em frangos de corte sob estresse térmico

O desempenho das aves esta relacionado com muitos fatores, que devem ocorrer de maneira totalmente integrada e coordenada visando a máxima eficiência produtiva. A busca por animais cada vez mais eficientes deixa claro a necessidade de conhecer melhor como os fatores nutricionais da dieta, e os fatores externos, como a temperatura ambiental estão envolvidos no desempenho das aves, em função das modificações ocorridas devido a mudanças fisiológicas em nível celular e/ou molecular. Sendo assim, este trabalho teve como objetivos avaliar os efeitos do estresse térmico agudo e crônico e da suplementação de duas fontes de metionina, sobre a eficiência produtiva e a regulação da expressão gênica em frangos de corte. Para isso, no primeiro experimento os frangos de corte de 21-42 dias de idade foram avaliados em três períodos experimentais: 24 horas de avaliação (21 a 22 dias de idade); 10 dias de avaliação (22 a 32 dias de idade); e 20 dias de avaliação (21-42 dias de idade), os frangos foram criados em temperatura de conforto térmico (21ºC) e exposto ao estresse térmico contínuo de 30ºC. Em ambos os grupos, os animais foram alimentados com dieta sem suplementação de metionina (SM); com suplementação de metionina como aminoácido livre (DL-M); e com suplementação de metionina na forma de dipeptídeo (DL-MM). Para o segundo experimento, os frangos de corte de 22-42 dias de idade foram divididos em duas temperaturas ambientais: um grupo foi criado no conforto térmico de 21ºC e o outro grupo em temperatura elevada de 30ºC dos 22-42 dias. Para ambos os grupos, os frangos foram alimentados com dieta sem suplementação de metionina (SM); com suplementação de metionina como aminoácido livre (DL-M); e com suplementação de metionina na forma de dipeptídeo (DL-MM). Nestes experimentos, foram avaliados, o desempenho, a qualidade da carne, parâmetros sanguíneos, a relação heterófilo/linfócito, a expressão e a metilação do DNA na região promotora dos genes relacionados a capacidade antioxidante: glutationa peroxidase (GPx), glutationa sintetase (GSS), e alguns marcadores biológicos do estresse oxidativo. No primeiro trabalho, foi observado que o estresse térmico reduziu o consumo de ração e o ganho de peso dos animais. No entanto, a suplementação com metionina melhorou o ganho de peso. Aos 32 dias de idade, os frangos criados em condições de estresse térmico apresentaram menor teor de HDL e maior de LDL que os que foram criados em conforto térmico e aves alimentadas com dieta SM apresentaram maior conteúdo de TGI. Aos 42 dias de idade não foi observado diferença entre os frangos criados no estresse térmico e alimentados com dieta DL-MM dos mantidos em conforto térmico. Para a carne do peito aos 42 dias de idade, os frangos de corte criados em condições de estresse térmico e alimentados com dieta SM apresentaram menor valor de pH final. Os frangos criados em ambiente de conforto térmico e alimentados com dieta DL-M e DL-MM tiveram menor perda por cocção que os animais alimentados com dieta SM. Sob estresse térmico, frangos de corte alimentados com DL-M tiveram a menor perda por cocção. A maior perda por descongelamento foi observada em aves alimentadas com dieta SM e a menor em animais alimentados com dieta DL-MM. Para a carne da perna, o estresse térmico reduziu o valor de pH final e elevou o valor do componente L*. Os frangos de corte alimentados com dietas SM e DL-MM apresentaram, respectivamente, os menores e maiores valores de pH final. Aves alimentadas com dieta SM apresentaram maior valor de descongelamento e perda por cocção. No segundo experimento em que se avaliaram os efeitos da suplementação de duas fontes de metionina e do estresse térmico crônico, observou-se que aves criadas sob estresse térmico crônico apresentaram significativamente maior relação Heterófilo/Linfócito. Para aves criadas sob condições de estresse térmico, frangos de corte alimentados com dieta DL-M apresentaram tendência de menor relação H/L que as aves alimentadas com dietas SM e DL-MM. Maior concentração de proteínas carboniladas e menor concentração de glutationa (GSH) foram significativamente observadas em aves criadas em estresse térmico crônico em relação as aves do conforto térmico. Ao comparar as aves criadas sob estresse térmico crônico, aves alimentadas com dieta DL-M apresentaram menor concentração de TBARS e proteínas carboniladas que aves recebendo dieta SM. Maior expressão dos genes GPx e GSS foi observada em frangos de corte criados em ambiente de estresse térmico crônico. As aves que receberam a dieta SM tiveram expressão da GPx aumentada, e maior expressão da GSS em comparação com os frangos de corte que receberam a dieta SM em temperatura de conforto térmico. Em condições de estresse crônico, aves alimentadas com dieta DL-MM apresentaram os maiores valores de metilação na região promotora dos genes GPx e GSS. Foi observado efeito negativo entre a metilação do DNA e os níveis de expressão gênica. Os frangos no estresse, apresentaram menores níveis de metilação e maiores níveis de expressão que aves criados em ambiente de conforto recebendo ambas as dietas. O estresse calórico reduziu o consumo de ração. Entanto, a suplementação com metionina melhorou o ganho de peso. Assim, nosso resultados sugerem que o estresse calórico agudo e crônico pode afetar o desempenho e alterar o metabolismo em frangos, e que a suplementação de metionina, independente da forma, pode ajudar a atenuar os efeitos do estresse mediante ação dos genes relacionados ao mecanismo antioxidante da glutationa.

The performance of the birds is a function of many factors, which must occur in a fully integrated and coordinated aiming to maximize productive efficiency.The search for increasingly efficient animals makes clear the need to know better how the nutritional factors of the diet, and external factors, as the ambient temperature are involved in the performance of the birds, due to the changes occurred due to physiological changes at the cellular and / or molecular leve. The objective of this study was to evaluate the effects of acute and chronic thermal stress and the supplementation of two sources of methionine on the production efficiency and the regulation of gene expression in broilers. For this, in the first experiment the broilers of 21-42 days of age were evaluated in three experimental periods: 24 hours of evaluation (21 to 22 days of age); 10 days of evaluation (22 to 32 days of age); and 20 days of evaluation (21-42 days of age), broiler chickens were reared at thermal comfort temperature (21ºC) and exposed to continuous thermal stress at 30ºC. In both groups, the animals were fed a diet without methionine supplementation (SM); with methionine supplementation as free amino acid (DL-M); and with methionine supplementation as dipeptide (DL-MM). For the second experiment, 22-42-day-old broiler chickens were divided into two environmental temperatures: one group was created in thermal comfort at 21ºC and the other at a high temperature of 30ºC from 22-42 days. For both groups, the broilers were fed a diet without methionine supplementation (SM); with methionine supplementation as free amino acid (DL-M); and with methionine supplementation in dipeptide form (DL-MM). Performance, meat quality, blood parameters, heterophile / lymphocyte ratio, DNA expression and methylation in the promoter region of genes related to antioxidant capacity: glutathione peroxidase (GPx), glutathione synthetase (GSS), and some biological markers of oxidative stress. In the first study, it was observed that the thermal stress reduced the feed consumption and the weight gain of the animals. However, methionine supplementation improved weight gain. At 32 days of age, broilers raised under heat stress had lower HDL and higher LDL levels than those raised in thermal comfort, and birds fed SM diet presented higher TGI contents. At 42 days of age no difference was observed between broilers raised in the thermal stress and fed with DL-MM diet of those kept in thermal comfort. For broiler meat at 42 days of age, broiler chickens raised under thermal stress conditions and fed SM diet had lower final pH values. Broilers raised in a thermal comfort environment and fed with DL-M and DL-MM diet had loss of cooking than animals fed SM diet. Under thermal stress, broilers fed DL-M had the lowest cooking loss. The highest loss by thawing was observed in birds fed SM diet and the lowest in animals fed DL-MM diet. For the leg meat, the thermal stress reduced the final pH value and raised the value of the L *. Broilers fed SM and DL-MM diets presented, respectively, the lowest and highest final pH values. Birds fed SM diet showed higher thawing value and cooking loss. In the second experiment in which we evaluated the effects of supplementation of two sources of methionine and chronic thermal stress, we observed that birds raised under chronic thermal stress had a significantly higher Heterophile / Lymphocyte ratio. For birds raised under thermal stress conditions, broilers fed DL-M diet showed a tendency of lower Heterophile / Lymphocyte ratio than birds fed SM and DL-MM diets. Higher concentration of carbonylated proteins and lower concentration of glutathione (GSH) were significantly observed in birds raised in chronic thermal stress in relation to birds of thermal comfort. When comparing birds raised under chronic thermal stress, birds fed DL-M diet presented lower concentration of TBARS and carbonylated proteins than birds receiving SM diet. Higher expression of the GPx and GSS genes was observed in broilers raised in a chronic thermal stress environment. Birds that received the SM diet had increased GPx expression and higher GSS expression compared to broiler chickens that received the SM diet at thermal comfort temperature. Under conditions of chronic stress, birds fed DL-MM diet had the highest values of methylation in the GPx and GSS promoter region. Negative effect was observed between DNA methylation and levels of gene expression. The chickens under stress had lower levels of methylation and higher levels of expression than birds raised in a comfort environment receiving both diets. Caloric stress reduced feed intake. However, methionine supplementation improved weight gain. Thus, our results suggest that acute and chronic caloric stress may affect performance and alter metabolism in broilers, and that methionine supplementation, regardless of form, may help to attenuate the effects of stress through the action of genes related to the antioxidant mechanism of glutathione.

SELEÇÃO DE GENES DE REFERÊNCIA PARA NORMALIZAÇÃO DA EXPRESSÃO GÊNICA EM TECIDOS DE CODORNA

A coturnicultura de corte está em crescente desenvolvimento e necessita de maiores estudos no campo genético para o direcionamento produtivo. Sendo a técnica da PCR em tempo real (RT-qPCR) uma das mais importantes na análise da expressão gênica, estudos e, experimentações relacionadas a seus componentes se fazem necessários. Dentre esses componentes encontra-se o gene de referência, normalizador de dados que possui grande impacto nos resultados e tem influência direta no sucesso da análise, devendo este possuir expressão significativa no tecido de forma invariável em todas as condições experimentais. Desse modo, objetivou-se determinar o perfil de transcritos expressos de genes de referência em tecidos sólidos de codorna de corte. Foram analisadas a estabilidade de dez genes constitutivos (ACTA1, ACTB, B2M GAPDH, HMBS, HPRT1, SDHA, MRPS27, MRPS30 e RPL5) no músculo do peito, gordura abdominal, fígado e intestino entre os grupos macho e fêmea, a partir dos programas BestKeeper, NormFinder, geNorm e método Ct, gerados pela ferramenta online RefFinder. Observou-se que o HPRT1 foi o mais estável em todos os tecidos analisados, seguindo por MRPS30 no peito, B2M na gordura abdominal, HMBS no fígado e RPL5 no intestino. Houve efeito do sexo na estabilidade dos genes testados, sendo que os genes mais estáveis para os animais machos foram: HPRT1 > MRPS30 > SDHA e, para fêmeas os genes RPL5 > HPRT1 > MRPS30. Estes resultados podem ajudar em ensaios de RT-qPCR que avaliem estes tecidos de codornas machos ou fêmeas, uma vez que fornece dados sobre quais genes são mais estáveis e podem ser testados como candidatos a genes de referência nas demais condições experimentais.

Cutting coturniculture is in increasing development and requires further studies in the field For productive steering. The real-time PCR technique (RT-qPCR) is one of the most Important in the analysis of gene expression, studies, and experiments related to its components. Necessary. Among these components is the reference gene, the data normalizer that Has a great impact on results and has a direct influence on the success of the analysis. Significant expression in the tissue invariably in all experimental conditions. Thus, The aim of this study was to determine the profile of expressed transcripts of reference genes in solid quail tissues Cutting. The stability of ten constitutive genes (ACTA1, ACTB, B2M GAPDH, HMBS, HPRT1, SDHA, MRPS27, MRPS30 and RPL5) in the chest muscle, abdominal fat, liver and intestine Male and female groups, from the BestKeeper, NormFinder, geNorm and Ct methods generated by the RefFinder online tool. It was observed that HPRT1 was the most stable in all tissues analyzed, Followed by MRPS30 in the chest, B2M in abdominal fat, HMBS in the liver and RPL5 in the gut. There was Of the sex in the stability of the genes tested, being the most stable genes for the male animals were: HPRT1> MRPS30> SDHA and, for females, the RPL5> HPRT1> MRPS30 genes. These results may help In RT-qPCR assays that evaluate these tissues of male or female quails, as it provides data On which genes are more stable and can be tested as reference gene candidates in the remaining Experimental conditions.