Resumo
A bactéria fitopatogênica Xanthomonas axonopodis pv. citri (Xac) é o agente causal do cancro cítrico, responsável por perdas significativas na citricultura nacional e mundial. Com a finalidade de se obter um primeiro mapa proteômico de referência da Xac, as bactérias foram cultivadas em dois meios não indutores de virulência (meios CN e TS8), e as proteínas foram digeridas com tripsina e analisadas pela tecnologia de MudPIT (Tecnologia de Identificação Multidimensional de Proteínas). Trinta e nove por cento de todas as proteínas preditas pelo genoma da Xac foram identificadas através de seus peptídeos, e estão distribuídas em todas as categorias funcionais. Além disso, 25% das proteínas designadas como hipotéticas conservadas do genoma foram identificadas. Outro objetivo deste trabalho foi analisar o perfil de expressão protéico durante a patogênese decorrente do contato Xac::citros. Para isso, Xac em condição infectante foi cultivada em meio indutor de virulência XAM1 por 24 h, ou recuperadas de folhas de laranjeiras inoculadas após 3 ou 5 dias de infecção, tendo como referência a Xac cultivada em meio CN. A tecnologia 20 + MS detectou 228 proteínas diferencialmente expressas em condição infectante, e a tecnologia MudPIT identificou 1.679 proteínas de Xac. Um total de 57 proteínas diferenciais [17 (20 + MS) + 40 (MudPIT)] associadas à patogenicidade e virulência, na interação Xac::citros são discutidas neste trabalho, destacando-se proteínas do Sistema de Secreção Tipo 111 (SSTT), 11 (SSTO) e IV (SSTO), efetoras do SSTT, proteínas relacionadas a estresse, goma xantana, carência nutricional, entre outras
The phytopathogenic bacteria Xanthomonas axonopodis pv. citri (Xac) is the causal agent of the citrus canker disease, which responds for important losses in national and worldwide citriculture. In arder to obtain the first proteomic reference map of Xac, the bacterium was grown on two non-inductive media for bacterial virulence (CN and TSB media) and proteins were proteolysed with trypsin and analyzed by MudPIT technology (Multidimensional Protein Identification Technology). Thirty nine per cent of ali predicted proteins from Xac genome were identified with their component peptides as belonging to ali functional categories. Besides, 25% of proteins described as conserved hypothetical in Xac's genome were identified. Another aim of this study was to analyze the proteome profile during Xac::citrus pathogenesis. For this reason, infecting Xac was grown in XAM1 virulence inductive medium for 24 h, or recovered from infected citrus leaves at 3 or 5 days of infection, taking Xac grown on CN medium as reference. The 20 + MS technology has detected 228 differentially expressed proteins in infecting conditional, and MudPIT technology identified 1679 Xac proteins. A total of 57 differential proteins [17 (20 + MS) + 40 (MudPIT)] related to pathogenicity and virulence during Xac::citrus interaction are discussed in this study, emphasizing proteins of type 111 (SSTT), 11 (SSTO) and IV (SSTQ) secretion system, effectors of SSTT, proteins related to stress, xanthan gum, starvation, among others
Resumo
Muitas das questões relacionadas a como Xylella fastidiosa vive num ambiente cuja concentração de nutrientes é baixa, e como e porquê ela forma agregados nos vasos do xilema, devem estar relacionados com seu metabolismo. O seqüenciamento deste organismo forneceu informações para serem aplicadas em estudos genéticos funcionais, visando à elucidação da funcionalidade de vias metabólicas que possam estar intimamente ligadas à etiologia do amarelinho. O presente estudo foi conduzido com o objetivo de verificar a funcionalidade da via Glicolítica de X. fastidiosa através de estudo das isoenzimas fosfoglicose isomerase, aldolase ou gliceraldeído-3-fosfato liase, gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase e piruvato quinase presentes na via Glicolítica e a glicose 6-fosfato desidrogenase presente na Entner-Doudoroff, bem como a clonagem, expressão e a determinação da atividade da enolase. O gene da enolase é uma das 35 ORFs anotadas no cosmídeo 02F10, denominada XF1291. Estes estudos sugerem que a bactéria X. fastidiosa não utiliza a via Glicolítica no metabolismo de carboidratos, inferindo assim no elevado tempo de duplicação deste fitopatógeno. As atividades enzimáticas da enolase recombinante, da enolase nativa e das isoenzimas aldolase e gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase não foram detectadas, sugerindo que a X. fastidiosa utiliza a via Entner-Doudoroff para a formação de piruvato. São apresentadas evidências de que a regulação gênica e a presença de isoformas, com propriedades regulatórias diferentes, podem dificultar a compreensão do metabolismo de carboidratos em X. fastidiosa
Many of the questions related to how Xylella fastidiosa lives in an environmental with low concentration of nutrients, and the reason why she forms aggregates in xylem vessels should be related with its metabolism. However, the sequencing this organism provided information to be applied in functional genetic studies. These studies focus on elucidating the functionality of metabolic pathways that might be intimately involved in "amarelinho" etiology. The objective of this study was to verify the functionality of the Glycolytic pathways by studying the isozymes phosphoglucose isomerase, aldolase or glyceraldehyde-3-phosphato-lyase, glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase and pyruvate kinase in the Glycolytic pathway and glucose-6-phosphate dehydrogenase in Entner-Doudoroff pathway, as well as the cloning and expression of enolase and determination of its activity. The enolase gene is one of 35 ORFs annoted in 02F10 cosmid and denominated XF 1291. These studies suggested that X. fastidiosa bacterium does not use the Glycolitic pathway in the metabolism of carbohydrates, which might explain the long time of duplication presented by this phytopathogen. The enzymatic activities of recombinant enolase, native enolase and isozymes aldolase and glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase have not been detected, suggesting that X. fastidiosa uses the Entner-Doudoroff pathway to produce pyruvate. Evidences are presented that the regulation of genes and the presence of isoforms with different properties of regulation can make it difficult to understand the metabolism of carbohydrates in X. fastidiosa