Resumo
O óxido nítrico (NO), um radical livre altamente reativo, sintetizado a partir da L-arginina em L-citrulina e NO, e vem sendo demonstrado com inibidor da síntese de esteróides e apoptose das células da granulosa (CGS) luteinizadas de bovinos. O presente experimento utilizou o sistema de cultivo quimicamente definido constituído de DMEM/Ham`s F12 com hepes, bicarbonato, insulina, transferrina, selenito de sódio e PVA no qual as CGs foram cultivadas com e sem FSH (experimento I) e livres de hemácias e macrófagos. O experimento I teve como objetivo padronizar a cultura e utilizar o modelo de cultivo que permitisse maior síntese de esteróides e nitrato/nitrito (NO3-/NO2-) ao longo do tempo. As CGs antrais de folículos pequenos de 3-5 mm foram puncionadas e centrifugadas. Posteriormente, as CGs foram tratadas com cloreto de amônio para retirada de hemácias e cultivadas por 2 horas para retiradas de macrófagos. Em seguida, 5 x 105 células/ml foram semeadas em placas de 24 poços por 24, 48, 72, 96 e 120 horas. No final de cada período de cultura, a viabilidade celular foi mensurada pela habilidade das células vivas reduzirem o sal tetrazolium 3-?4,5-dimetiltrazol-2yl?-2,5 -brometo de difeniltetrazolium em azul de formazan (MTT). Enquanto, as amostras de CGs foram coletadas para análise do ciclo celular por citometria de fluxo e do meio de cultivo, para mensuração das concentrações de 17?-estradiol (E2) e progesterona (P4) por quimiluminescência e de nitrato/nitrito (NO3-/NO2-) pelo método Griess. O sistema de cultivo aumentou (P<0,05) a síntese de esteróides ao longo do tempo e manteve as características morfológicas das CGs esteroidogênicamente ativas. O FSH aumentou (P<0,05) a proliferação no final de 48 horas a viabilidade celular no final de 72 horas a viabilidade celular, que foi mantida até 120 horas de cultivo não diferindo (P>0,05) do controle. As CGs mantiveram características morfológicas de células esteroidogênica condizentes com a literatura. O FSH estimulou a síntese de 17 ? estradiol (E2) no final de 24 horas cultivo comparado ao controle, e posteriormente diminuiu e permaneceu menor que a síntese de E2 pelas CGs cultivadas sem FSH durante todo o período de cultivo. Não houve variação na síntese de progesterona (P4) pelas CGs cultivadas com FSH ao longo do tempo. Além disso, a síntese de P4 estimulada pelo FSH foi menor no final dos períodos de 72 e 96 horas em relação ao controle. A síntese de nitrato/nitrito (NO3-/NO2-) pelas CGs não variou sem e com FSH ao longo do tempo entre e não houve diferença na síntese de (NO3-/NO2-) pelo FSH comparado ao controle. Tendo em vista que o sistema de cultivo sem FSH, somente com insulina manteve a síntese de esteróides até o final do cultivo sem variação na síntese NO3-/NO2-. Este sistema foi utilizado para os experimentos II e III. No experimento II o mesmo procedimento foi adotado para CGs, desde a obtenção das CGs até o cultivo, obtenção das amostras de meio e CGs e análises das mesmas. O experimento II objetivou verificar o efeito do nitroprussíato de sódio (SNP) nas concentrações 10-9, 10-7 e 10-5 M na viabilidade, apoptose e esteroidogênse das CGs. A viabilidade celular aumentou (P<0,05) no final de 120 horas de cultivo para todos os tratamentos com SNP em relação ao controle. Todas as concentrações de SNP aumentaram a % de células da granulosa na fase S e G2 do ciclo celular com 48 e 72 horas de cultivo comparado ao controle. A síntese de E2 foi estimulada (P<0,05), enquanto, a de P4