Medium and time conservation affect follicular morphology and superoxide dismutase enzyme activity of bovine preantral follicles during storage at 4ºC / Meio e tempo de conservação afetam a morfologia folicular e atividade da enzima superóxido dismutase de folículos pré-antrais bovinos durante a conservação a 4 ºC

The aim of this study was to evaluate the morphology and superoxide dismutase enzyme (SOD) activity of bovine preantral follicles (PFs) preserved in TCM 199, saline solution or PBS at different conservation periods. Cow ovaries (n=6) were divided into 7 fragments. One small piece of each ovarian fragment was randomly removed to evaluate SOD activity, while the remainder was immediately fixed for morphological evaluation as a control group. The other 6 fragments were randomly distributed in tubes containing TCM 199, saline solution, or PBS and maintained at 4ºC for 6 or 24 h. For histological evaluation, the fragments were fixed in Carnoy and stained with PAS-hematoxylin, following being classified PFs in relation to their follicular morphology in normal or degenerated. Determination of SOD activity was based on the ability to inhibit autoxidation of adrenaline in adrenochrome. Evaluation of follicular morphology showed that follicles preserved in TCM 199 for 6 h did not differ from the control (P > 0.05). In contrast, preservation in saline solution and PBS for 6 or 24 h and TCM 199 for 24 h decreased normal PFs compared to the control (P < 0.05). SOD showed a lower activity in ovarian cortical tissue kept in TCM 199 for 6 h and saline solution for 24 h than in the other groups. Our study shows that incubation using TCM 199 at 4°C for 6 h can be used to efficiently conserve female bovine PFs in situ.(AU)

O objetivo desse estudo foi avaliar a morfologia e atividade da enzima superóxido dismutase (SOD) de folículos pré-antrais bovinos (PFs) preservados em TCM 199, solução salina ou PBS por diferentes períodos de conservação. Ovários de vacas (n=6) foram divididos em 7 fragmentos. Um pequeno pedaço de cada fragmento ovariano foi removido para avaliar a atividade da SOD enquanto que o restante foi imediatamente fixado para avaliação morfológica como grupo controle. Os outros 6 fragmentos foram distribuídos aleatoriamente em tubos contendo TCM 199, solução salina ou PBS e mantidos a 4ºC por 6 ou 24 h. Para avaliação histológica, os fragmentos foram fixados em Carnoy e corados com PAShematoxilina, sendo classificados em seguida os PFs em relação à sua morfologia folicular em normal ou degenerados. A determinação da atividade da SOD foi baseada na capacidade de inibir a autooxidação da adrenalina no adrenocromo. A avaliação da morfologia folicular mostrou que os folículos preservados em TCM199 por 6 h não diferiram do controle (P > 0,05). Em contraste, a preservação em solução salina e PBS por 6 ou 24 h e TCM 199 por 24 h diminuiu os PFs normais em comparação com o controle (P < 0,05). A SOD mostrou uma menor atividade no tecido cortical ovariano mantido em TCM 199 por 6 h e solução salina por 24 h do que nos outros grupos. Nosso estudo mostra que a incubação usando TCM 199 a 4° C por 6 h pode ser usada eficientemente para conservar PFs de fêmeas bovinas in situ.(AU)

Oxygen tension and oocyte density during in vitro maturation affect the in vitro fertilization of bovine oocytes / A tensão de oxigênio e a densidade de oócitos durante a maturação in vitro afeta a fecundação in vitro de oócitos bovinos

Oocyte maturation is the key factor affecting the fertilization and embryonic development. Factors such as oocyte density and oxygen tension can directly influence the IMV. Thus, the objective of this study was to evaluate the effect of the association of oxygen tensions (5% or 20%) with different oocyte densities (1:10μl or 1:20μl) in the in vitro maturation (IVM) of bovine oocytes on maturation and fertilization rates, ROS production and antioxidant activity. Three experiments were performed with bovine oocytes that were obtained from slaughterhouse ovaries. After selection, the oocytes were randomly distributed in four treatments: 1:10/5%; 1:10/20%; 1:20/5%and 1:20/20% for each experiment. In experiment I, nuclear maturation status and cytoplasmic maturation were evaluated through detection of the first polar body by immunofluorescence and the mitochondrial reorganization assay. In experiment II, ROS production and antioxidant activity were analyzed in oocytes and IVM medium after 24 h of maturation through detection of ROS, reduced glutathione (GSH) and Superoxide dismutase activity by spectrofluorimetric methods. In experiment III, fertilization was evaluated through pronucleus formation, sperm penetration with or without decondensation and polyspermy rates by immunofluorescence. In experiment I, the nuclear maturation and cytoplasmic maturation were similar among treatments (P>0.05). In experiment II, reactive oxygen species in oocytes were elevated in treatments with low oxygen tension which was independent of oocyte density (P<0.05). Additionally, ROS levels in IVM medium were higher in treatments with high oocyte density by volume of medium, which was independent of oxygen tension (P<0.05). In Experiment III, the fertilization and penetration rates were higher in the treatment with 20% oxygen tension and high oocyte density (P<0.05). (AU)

A maturação dos oócitos é o fator chave que afeta a fecundação e o desenvolvimento embrionário. Fatores como a densidade de oócitos e a tensão de oxigênio podem influenciar diretamente a maturação in vitro (MIV) de oócitos bovinos. O objetivo do presente estudo foi avaliar o efeito da associação da tensão de oxigênio (5% ou 20%) com diferentes densidades de oócitos (1:10μl ou 1:20μl) MIV de oócitos bovinos, na taxa de maturação, fecundação, produção de espécies reativas ao oxigênio (ROS) e defesas antioxidantes. Três experimentos foram conduzidos com oócitos obtidos de ovários de abatedouro. Após a seleção, os oócitos foram distribuídos homogeneamente em quatro tratamentos: 1:10/5%; 1:10/20%; 1:20/5% e 1:20/20%. No experimento I, o status da maturação nuclear e citoplasmática foram avaliados pela detecção do primeiro corpúsculo polar por epifluorescência e avaliação da reorganização das mitocôndrias. No experimento II, a produção de EROs e atividade antioxidante foram analisadas nos oócitos e no meio de MIV após 24h de maturação pela detecção de ROS, redução da glutationa (GSH) e atividade da Superoxido Dismutase por métodos de espectrofluorometria. No experimento III, foram avaliadas as taxas de fecundação pela formação dos pro-núcleos, penetração com ou sem descondensação espermática e poliespermia por epifluorescência. No experimento I, a maturação nuclear e citoplasmática foi similar entre os tratamentos (P>0,05). No experimento II, os níveis de ROS nos oócitos foram elevados nos tratamentos com baixa tensão de oxigênio (5%) independente da densidade de oócitos (P<0,05). Adicionalmente os níveis de ROS no meio de MIV foram maiores nos tratamentos com alta densidade de oócitos por volume de meio, independente da tensão de oxigênio (P<0,05). No experimento III, a taxa de fecundação e penetração espermática foi maior nos tratamentos com 20% de oxigênio e alta densidade de oócitos (P<0,05).(AU)

Oxygen tension and oocyte density during in vitro maturation affect the in vitro fertilization of bovine oocytes / A tensão de oxigênio e a densidade de oócitos durante a maturação in vitro afeta a fecundação in vitro de oócitos bovinos

Oocyte maturation is the key factor affecting the fertilization and embryonic development. Factors such as oocyte density and oxygen tension can directly influence the IMV. Thus, the objective of this study was to evaluate the effect of the association of oxygen tensions (5% or 20%) with different oocyte densities (1:10μl or 1:20μl) in the in vitro maturation (IVM) of bovine oocytes on maturation and fertilization rates, ROS production and antioxidant activity. Three experiments were performed with bovine oocytes that were obtained from slaughterhouse ovaries. After selection, the oocytes were randomly distributed in four treatments: 1:10/5%; 1:10/20%; 1:20/5%and 1:20/20% for each experiment. In experiment I, nuclear maturation status and cytoplasmic maturation were evaluated through detection of the first polar body by immunofluorescence and the mitochondrial reorganization assay. In experiment II, ROS production and antioxidant activity were analyzed in oocytes and IVM medium after 24 h of maturation through detection of ROS, reduced glutathione (GSH) and Superoxide dismutase activity by spectrofluorimetric methods. In experiment III, fertilization was evaluated through pronucleus formation, sperm penetration with or without decondensation and polyspermy rates by immunofluorescence. In experiment I, the nuclear maturation and cytoplasmic maturation were similar among treatments (P>0.05). In experiment II, reactive oxygen species in oocytes were elevated in treatments with low oxygen tension which was independent of oocyte density (P<0.05). Additionally, ROS levels in IVM medium were higher in treatments with high oocyte density by volume of medium, which was independent of oxygen tension (P<0.05). In Experiment III, the fertilization and penetration rates were higher in the treatment with 20% oxygen tension and high oocyte density (P<0.05).

A maturação dos oócitos é o fator chave que afeta a fecundação e o desenvolvimento embrionário. Fatores como a densidade de oócitos e a tensão de oxigênio podem influenciar diretamente a maturação in vitro (MIV) de oócitos bovinos. O objetivo do presente estudo foi avaliar o efeito da associação da tensão de oxigênio (5% ou 20%) com diferentes densidades de oócitos (1:10μl ou 1:20μl) MIV de oócitos bovinos, na taxa de maturação, fecundação, produção de espécies reativas ao oxigênio (ROS) e defesas antioxidantes. Três experimentos foram conduzidos com oócitos obtidos de ovários de abatedouro. Após a seleção, os oócitos foram distribuídos homogeneamente em quatro tratamentos: 1:10/5%; 1:10/20%; 1:20/5% e 1:20/20%. No experimento I, o status da maturação nuclear e citoplasmática foram avaliados pela detecção do primeiro corpúsculo polar por epifluorescência e avaliação da reorganização das mitocôndrias. No experimento II, a produção de EROs e atividade antioxidante foram analisadas nos oócitos e no meio de MIV após 24h de maturação pela detecção de ROS, redução da glutationa (GSH) e atividade da Superoxido Dismutase por métodos de espectrofluorometria. No experimento III, foram avaliadas as taxas de fecundação pela formação dos pro-núcleos, penetração com ou sem descondensação espermática e poliespermia por epifluorescência. No experimento I, a maturação nuclear e citoplasmática foi similar entre os tratamentos (P>0,05). No experimento II, os níveis de ROS nos oócitos foram elevados nos tratamentos com baixa tensão de oxigênio (5%) independente da densidade de oócitos (P<0,05). Adicionalmente os níveis de ROS no meio de MIV foram maiores nos tratamentos com alta densidade de oócitos por volume de meio, independente da tensão de oxigênio (P<0,05). No experimento III, a taxa de fecundação e penetração espermática foi maior nos tratamentos com 20% de oxigênio e alta densidade de oócitos (P<0,05).