Resumo
No presente trabalho foi realizado o teste da cristalização lacrimal (TCL) em amostras de sessenta felinos domésticos hígidos e análise proteômica do fluido lacrimal (FL) de doze felinos. O TCL é um teste oftálmico de caráter qualitativo, visando avaliar a osmolaridade indireta do FL. Ainda não havia sido realizado em amostras da espécie felina, mas, apesar de originalmente desenvolvido para a espécie humana, já foi adaptado para cães, cavalos, macacos e camelos. Como forma complementar, tem-se desenvolvido diferentes técnicas de análise proteômica para avaliação do FL, visando identificação de proteínas que possam ser utilizadas como biomarcadores para diagnóstico precoce, prognóstico, desenvolvimento de novos fármacos, bem como para elucidar a fisiologia de sistemas e fisiopatologia de alterações. Objetivou-se verificar o enquadramento de amostras de felino nas escalas propostas para classificação do TCL de humanos, e, descrever as proteínas encontradas no FL de indivíduos dessa espécie. Para tal, as amostras de FL para TCL foram coletadas através do Teste de Schirmer 1 (TLS-1), e, as tiras logo após o teste foram acondicionadas em microtubos e centrifugadas para obtenção da alíquota que era depositada em uma lâmina microscópica de vidro, analisada através do microscópio de luz polarizada, e registrada através de fotos. Enquanto as amostras para análise proteômica também foram obtidas por TLS-1, acondicionadas em microtubos que foram submetidos a centrifugação refrigerada a 4ºC, porém a alíquota era imediatamente congelada até posterior análise por espectrometria de massas (EM) com gel bidimensional de poliacrilamida (2D-SDS-PAGE) associada a cromatografia líquida de alta eficiência (ULPC). A cristalização de amostras de felinos apresentou alta densidade de cristais, poucas lacunas entre os ramos, e, grande quantidade de núcleos facilmente visíveis. Os ramos são finos e suas ramificações primárias e secundárias bem definidas. Os tipos I e II da escala de Rolando e os graus 1 e 2 da escala de Masmali foram os mais comumenteVII observados (50%, 46,6%, 56,6% e 28,4%, respectivamente) das escalas propostas. A distribuição normal não foi encontrada para as classificações obtidas (P<0,001) bem como não foi observada diferença entre classificações dos olhos direito e esquerdo (P0,102). Proteínas já descritas em estudos com amostras de FL de outras espécies foram descritas pela primeira vez em felinos, como: lactotransferrina, albumina sérica e lipocalinas alérgenas. Oito outras proteínas foram descritas nas amostras de felinos e podem ser consideradas inéditas em amostras de FL de todas as espécies, dentre elas estão: três proteínas quinase dependentes da ciclina, o receptor de apelina, proteína secretória relacionada ao C1q/TNF, aciltransferase, -1,4 glucano fosforilase e o domínio de repetição WD-1. O TCL pode ser considerado de boa aplicabilidade em felinos como uma avaliação complementar da superfície ocular, e, a técnica de proteômica escolhida superou as limitações relacionada ao pequeno volume de amostra e apresentou alta sensibilidade na identificação de proteínas. Mais estudos da aplicabilidade das escalas do TCL, bem como da expressão de proteínas do FL de felinos são necessários e podem trazer no futuro grande auxílio na prevenção, diagnóstico precoce, prognóstico, bem como tratamento de doenças oftálmicas e até mesmo sistêmicas.
In the present study Tear Ferning Test (TFT) was performed in samples of sixty healthy domestic cats, and proteomic analysis of the Tear Film (TF) in twelve cats. TFT is a qualitative ophthalmic test that evaluate the indirect osmolarity of TF. It had not yet been performed on feline specimens, and although it was originally developed for humans, it has been used on dogs, horses, capuchin monkeys and camels. As a complementary tool, different proteomic techniques have been developed for the evaluation of TF, aiming to identify proteins that can be used as biomarkers for early diagnosis, prognosis, development of new drugs, as well as to elucidate the systems physiology and pathophysiology of diseases. The aim of this study was to verify the classification of feline samples in the proposed scales for TFT of humans, and to describe the proteins found in the TF of this species. For that purpose, the TF samples for TFT were collected through Schirmer Tear Test 1 (STT-1), the strips were placed in microtubes immediately after, and centrifuged to obtain the aliquot that was deposited on a microscopic slide of glass, analyzed through the polarized light microscope and recorded through photograph. The samples for proteomic analysis were also obtained by STT-1, placed in microtubes, subjected to refrigerated centrifugation at 4ºC, and the aliquot was immediately frozen at 20 ºC until further analysis by mass spectrometry (MS) with two dimensional polyacrylamide electrophoresis (2DSDS-PAGE) associated with ultra-performance liquid chromatography (ULPC). Ferning patterns of cats TF samples showed full crystallization with high density, without gaps between the ferns and branches, forming several nuclei that were easily distinguished. The branches are thin and their primary and secondary branches well defined. Types I and II by Rolando scale and grades 1 and 2 by Masmali scale were the most observed (50%, 46.6%, 56.6% and 28.4%, respectively) of the proposed scales. Normal distribution was not found for the obtained classifications (P<0.001), as well as no difference was observedIX between classifications of the right and left eyes (P0.102). Proteins already described in studies with TF samples from other species have been described for the first time in felines, such as: lactotransferrin, serum albumin and lipocalin allergens. Eight other proteins that were found in feline samples can be considered new in TF samples of all species already reported so far, among them are: three cyclin-dependent protein kinase, the apelin receptor, secretory protein related to C1q/TNF, acyltransferase, -1,4 glucan phosphorylase and the WD-1 repeat domain. TFT can be feasible in cats as a complementary evaluation of the ocular surface, and, the chosen proteomics technique overcame the limitations related to the small sample volume and showed high sensitivity in the identification of proteins. Further studies on the use of TFT scales, as well as on the expression of feline TF proteins are needed and can bring in the future great help in prevention, early diagnosis, prognosis, as well as treatment of ophthalmic and systemic diseases.
Resumo
A Erliquiose Monocítica Canina (EMC) é uma doença causada pela bactéria Ehrlichia canis, que é transmitida através da picada do carrapato Rhipicephalus sanguineusdurante o repasto sanguíneo. A espécie E. canis tem alta prevalência em âmbito mundial e nacional, causando altas taxas de morbidade e mortalidade em cães domésticos. Dentre suas variadas manifestações clínicas, as alterações oftálmicas são consideradas de grande importância, pois podem causar cegueira permanente e ainda podem ser a única manifestação clínica da doença sistêmica. Objetivou-serealizarnested-PCR para diagnosticar infecção por E. canis em cães portadores de uveíte bilateral provenientes da casuística do Hospital Veterinário da Universidade Estadual de Santa Cruz. Para tal, 66 cães com uveíte bilateral foram submetidos asemiotécnica oftálmica e coleta de amostra de sangue, de onde foi extraído o DNA para realização do diagnóstico molecular. Foram positivos no teste 35 (53%)cães, sendo que 82,6% dos olhos destes animais possuíam iridociclite, uveíte posterior ou panuveíte, enquanto 17,4% apresentavam glaucoma secundário
Monocytic Canine Ehrlichiosis (CME) is a disease caused by the bacterium Ehrlichia canis, which is transmitted through the bite of the tick Rhipicephalus sanguineus during the blood repast. The E. canis species has high prevalence worldwide and national, causing high rates of morbidity and mortality in domestic dogs. Among its varied clinical manifestations, ophthalmic alterations are considered of great importance, since they can cause permanent blindness and may still be the only clinical manifestation of the systemic disease. The objective of this study was to verify the infection of E. canis in dogs with bilateral uveitis from the Veterinary Hospital of the State University of Santa Cruz. To that end, 66 dogs with bilateral uveitis were submitted to the ophthalmic technique and blood sample collection, from which the DNA was extracted for molecular diagnosis. 35 (53%) dogs were positive in the test, and 82.6% of the eyes of these animals had iridocyclitis, posterior uveitis or panuveitis, while 17.4% had secondary glaucoma