NANOEMULSÕES DE ALGINATO E ÓLEO ESSENCIAL DE Eucalyptus staigeriana: PRODUÇÃO, CARACTERIZAÇÃO, TOXICIDADE E ATIVIDADE ANTI-HELMÍNTICA SOBRE NEMATOIDES GASTRINTESTINAIS DE PEQUENOS RUMINANTES

O parasitismo por nematoides gastrintestinais (NGI) é uma grave ameaça a ovinocaprinocultura e com o aparecimento e disseminação da resistência anti-helmíntica (RA), novas alternativas de controle são necessárias. O óleo essencial de Eucalyptus staigeriana (OEEs) apresenta atividade anti-helmíntica, e o desenvolvimento de formulações visando o seu encapsulamento usando matriz de alginato de sódio (ALG) pode ser vantajoso para aumentar sua estabilidade e eficácia. Objetivando-se desenvolver emulsões de ALG e OEEs para o controle de NGI de pequenos ruminantes, a metodologia foi realizada em três fases. Na fase 1, cujo objetivo foi caracterizar uma população de Haemonchus contortus, nomeada Caucaia, quanto à RA, realizou-se a comparação entre testes fenotípicos de eclosão de ovos (TEO), desenvolvimento larvar (TDL) e redução de ovos nas fezes (TRCOF) e genotípico por qPCR para benzimidazois (BZs) e levamisol (LEV). Houve concordância entre TEO, TRCOF e qPCR para BZs, e entre TDL e qPCR para LEV. A população Caucaia foi considerada resistente a BZs, lactonas macrocíclicas, LEV e suspeita para monepantel. Na fase 2, objetivou-se desenvolver emulsões de ALG e OEEs, caracterizá-las e avaliar seus efeitos in vitro sobre eclosão de ovos e desenvolvimento larvar de H. contortus. Quatro emulsões foram preparadas com proporções variadas de Tween 80, OEEs e ALG 4%, caracterizadas físico-quimicamente e avaliadas no TEO e TDL. As emulsões foram estáveis, com tamanho de partícula predominantemente nanométrico e potencial zeta negativo. As emulsões foram mais efetivas que o OEEs no TEO, com concentração efetiva 50% (CE50) de 0,088 a 0,150 mg/mL para as emulsões e 0,308 mg/mL para OEEs. No TDL, emulsões e OEEs foram semelhantes, com CE50 variando de 3,91 a 4,60 mg/mL para emulsões e 4,17 mg/mL para OEEs. Portanto, emulsões de ALG e OEEs foram produzidas com sucesso, sendo a emulsão 2 (E2), com menor razão Tween 80/OEEs e ALG/OEEs, considerada a melhor e com potencial para o controle alternativo de H. contortus. Na fase 3, objetivou-se avaliar E2 in vitro contra H. contortus adultos, sua toxicidade aguda e atividade in vivo contra NGI. Foram realizados os testes de motilidade do adulto (TMA), avaliação por microscopia eletrônica de varredura (MEV) e confocal de varredura a laser (MCVL). A dose letal 50% (DL50) de E2 foi verificada e o TRCOF foi realizado contra NGI da população Caucaia. No TMA, OEEs e E2 inibiram a motilidade de H. contortus e nas concentrações de 0,4 e 0,6 mg/mL, E2 foi mais efetiva que o OEEs. As imagens de MEV e de MCVL demonstraram alterações estruturais, principalmente, enrugamento de cutícula. A DL50 estimada da emulsão foi superior a 2.000 mg/kg. No TRCOF, a eficácia do OEEs e de E2 foram similares, com 54,2% de redução no opg pós-tratamento. Portanto, E2 demonstrou efeito promissor contra H. contortus adultos in vitro, segurança toxicológica e atividade contra NGI in vivo. Dessa forma, foi possível produzir e caracterizar, de forma bem-sucedida, emulsões de ALG e OEEs, que demonstraram estabilidade e atividade anti-helmíntica contra NGI de pequenos ruminantes, com potencial para aplicação em futuros esquemas de tratamento alternativo.

Parasitism by gastrointestinal nematodes (GIN) is a serious threat to sheep and goat farming and due to emergence and spread of anthelmintic resistance (AR), new control alternatives are required. The essential oil of Eucalyptus staigeriana (EsEO) has anthelmintic activity, so the development of formulations aimed at its encapsulation using sodium alginate matrix (ALG) can be advantageous to increase its stability and effectiveness. Aiming to develop emulsions of ALG and EsEO to control GIN in small ruminants, the methodology was developed in three phases. In phase 1, whose objective was to characterize a population of Haemonchus contortus, named Caucaia, regarding AR, a comparison was made between phenotypic tests of egg hatch (EHT), larval development (LDT) and fecal egg reduction (FECRT) and genotypic by qPCR for benzimidazoles (BZs) and levamisole (LEV). There was agreement between EHT, FECRT and qPCR for BZs, and between LDT and qPCR for LEV. The Caucaia population was considered resistant to BZs, macrocyclic lactones, LEV and suspected for monepantel. In phase 2, the aim was to develop emulsions of ALG and EsEO, characterize them and evaluate their in vitro effects on egg hatching and larval development of H. contortus. Four emulsions were prepared by varying proportions between Tween 80, EsEO and 4% ALG, physicochemically characterized and evaluated on EHT and LDT. The emulsions were stable, with predominantly nanometric particle size and negative zeta potential. The emulsions were more effective than EsEO in EHT, with effective concentration 50% (EC50) ranging from 0.088 to 0.150 mg/mL for the emulsions and 0.308 mg/mL for EsEO. In LDT, emulsions and EsEO were similar, with EC50 ranging from 3.91 to 4.60 mg/mL for emulsions and 4.17 mg/mL for EsEO. Therefore, ALG and EsEO emulsions were successfully produced, and emulsion 2 (E2), with low levels of the ratio between Tween 80/EsEO and ALG/EsEO was considered the best and with potential for alternative control of H. contortus. In phase 3, the aim was to evaluate E2 in vitro against adult H. contortus, its acute toxicity and in vivo activity against GIN. Adult worm motility test (AWMT) was performed, evaluation by scanning electron microscopy (SEM) and confocal laser scanning microscopy (CLSM). The lethal dose 50% (LD50) of E2 was assessed and FECRT was performed against the Caucaia population GIN. In AWMT, EsEO and E2 inhibited the motility of H. contortus and at concentrations 0.4 and 0.6 mg/mL, E2 was more effective than EsEO. SEM and CLSM images showed structural changes, mainly cuticle wrinkling. The LD50 of the emulsion was estimated to be greater 2,000 mg/kg. In FECRT, the efficacy of EsEO and E2 were similar, with a 54.2% reduction in epg post-treatment. Therefore, E2 showed promising effect against adult H. contortus in vitro, toxicological safety and activity against GIN in vivo. In this way, it was possible to successfully produce and characterize emulsions of ALG and EsEO, which demonstrated stability and anthelmintic activity gainst GIN of small ruminants, with potential for application in future alternative treatment schemes.

EFEITO DO ÓLEO ESSENCIAL DE Eucalyptus citriodora E CITRONELAL SOBRE ISOLADOS DE Haemonchus contortus SENSÍVEL E RESISTENTE A ANTI-HELMÍNTICOS SINTÉTICOS

O controle de nematoides gastrintestinais de pequenos ruminantes é baseado na administração de anti-helmínticos sintéticos. Contudo, a utilização destes fármacos seleciona parasitos resistentes e faz com que o controle seja ineficiente, tornando imprescindível a busca por alternativas. Os produtos derivados de plantas têm sido amplamente investigados quanto ao seu potencial como anti-helmíntico. Entretanto, tem sido constatado que a variabilidade entre seus constituintes, bem como a variabilidade do nematoide utilizado como modelo experimental, podem influenciar a atividade anti-helmíntica dos produtos naturais. Portanto, os objetivos desse estudo foram verificar se a eficácia do óleo essencial de Eucalyptus citriodora sobre Haemonchus contortus é decorrente do seu composto majoritário, o citronelal, e avaliar se a atividade do óleo e do citronelal é influenciada pelo perfil de sensibilidade de H. contortus a anti-helmínticos sintéticos. Para isso, o óleo essencial de E. citriodora e o citronelal foram adquiridos comercialmente e o óleo foi submetido à análise química. O óleo e o citronelal foram avaliados no teste de eclosão de ovos (TEO), teste de desenvolvimento larvar (TDL) e teste de motilidade do nematoide adulto (TMA). Para realizar estes ensaios, dois isolados de H. contortus com diferentes perfis de sensibilidade a anti-helmínticos sintéticos foram utilizados: um sensível (ISE) e um resistente (Kokstad). Os resultados foram submetidos à ANOVA e comparados pelos testes Tukey ou Bonferroni (P<0,05). As concentrações efetivas necessárias para inibir 50% (CE50) da eclosão de ovos, desenvolvimento larvar e motilidade dos adultos, além do fator de resistência (FR) foram calculados. A análise cromatográfica confirmou o citronelal como principal constituinte do óleo (63,9%). Nas maiores concentrações testadas, o óleo e o citronelal demonstraram eficácia sobre os três estágios de H. contortus (P<0,05). No TEO, as CE50 do óleo e citronelal para o isolado ISE foram 0,4 e 0,3 mg/mL e para o isolado Kokstad foram 0,5 e 0,4 mg/mL, respectivamente (P>0,05 entre isolados). No TDL, as CE50 do óleo e do citronelal para o isolado sensível foram 2,9 e 2,3 mg/mL e para o isolado Kokstad foram 3,2 e 2,4 mg/mL, respectivamente (P>0,05 entre isolados). No TMA, as CE50 do óleo para o isolado sensível e resistente foram 0,5 e 1,1 mg/mL, respectivamente (P<0,05). No mesmo teste, as CE50 do citronelal para os isolados ISE e Kokstad foram estatisticamente semelhantes (1,2 mg/mL para ambos). O FR entre os isolados para o óleo essencial e seu principal constituinte variou de 1,1-2,2 e 1-1,3, respectivamente. O citronelal possivelmente é o responsável pelo efeito ovicida e larvicida do óleo essencial de E. citriodora. Contudo, outros constituintes do óleo, além do citronelal, devem estar envolvidos no efeito sobre a motilidade de H. contortus,como demonstrado no TMA . A influencia do perfil de sensibilidade dos isolados de H. contortus foi observada apenas no TMA, pois o óleo essencial de E. citriodora demonstrou efeito superior contra o isolado sensível do que contra o isolado resistente.

The control of gastrointestinal nematodes of small ruminants is based on the administration of synthetic anthelmintics. However, the use of these drugs selects resistant parasites, what makes the control inefficient, making the search for alternatives something essential. Plant products have been widely investigated for their anthelmintic potential. However, it has been observed that the variability among its constituents, as well as the variability of the nematode used as an experimental model, may influence the anthelmintic activity of natural products. Therefore, the aims of this study were to verify if the efficacy of the essential oil of Eucalyptus citriodora on Haemonchus contortus is due to its major compound, citronellal, and to evaluate if the oil and citronellal activity is influenced by the sensitivity profile of H. contortus to synthetic anthelmintics. For this, the essential oil of E. citriodora and citronellal were purchased commercially and the oil was subjected to chemical analysis. The oil and citronellal were evaluated in the egg hatch test (EHT), larval development test (LDT) and adult nematode motility test (AWMT). In order to perform these tests, two isolates of H. contortus with different profiles of sensitivity to synthetic anthelmintics were used: one sensitive (ISE) and one resistant (Kokstad). The results were submitted to ANOVA and compared by the Tukey or Bonferroni tests (P <0.05). The effective concentrations required to inhibit 50% (EC50) of egg hatching, larval development and adult motility, in addition to the resistance ratio (RR) were calculated. Chromatographic analysis confirmed citronellal as the main constituent of the oil (63.9%). At the highest concentrations tested, oil and citronellal demonstrated efficacy on the three stages of H. contortus (P <0.05). In the EHT, the EC50 of the oil and citronellal for the ISE isolate were 0.4 and 0.3 mg/mL and for the Kokstad isolate were 0.5 and 0.4 mg/mL, respectively (P> 0.05 for both isolates). In the LDT, EC50 of the oil and citronellal for the sensitive isolate were 2.9 and 2.3 mg/mL and for the Kokstad isolate were 3.2 and 2.4 mg/mL, respectively (P> 0.05 for both isolates). In the AWMT, the EC50 of the oil for the sensitive and resistant isolate were 0.5 and 1.1 mg/mL, respectively (P <0.05). In the same test, citronellal EC50 for ISE and Kokstad isolates were statistically similar (1.2 mg/mL for both). The RR between the isolates for the essential oil and its main constituent ranged from 1.1-2.2 and 1-1.3, respectively. Citronellal is possibly responsible for the ovicidal and larvicidal effect of the essential oil of E. citriodora. However, other constituents of the oil, besides citronellal, should be involved in the effect on the motility of H. contortus, as demonstrated in the TMA The influence of the sensitivity profile of H. contortus isolates was observed only in AWMT, in which the essential oil of E. citriodora demonstrated a better effect against the ISE isolate than against the Kokstad isolate.