Purificação de fração enriquecida de binder of sperm protein 1 (BSP 1) do fluido seminal bovino através da técnica de precipitação por sulfato de amônio / Purification of enriched fraction of binder of sperm protein 1 (BSP1) from bovine seminal fluid by ammonium sulphate precipitation technique

Objetivou-se no presente estudo realizar purificação parcial da proteína binder of sperm protein1 (BSP1), proteína de 15 kDa presente nos fluidos das glândulas vesiculares de bovinos, por meio deprecipitação com sulfato de amônio. O fluido seminal foi extraído das glândulas vesiculares obtidas dedez touros bos indicus em abatedouro comercial de Fortaleza, Ceará. As glândulas foram transportadas eprocessadas no Laboratório de Fisiologia Animal da Universidade Federal do Ceará. Foi utilizado umcoquetel inibidor de proteases, com posterior centrifugação. Um pool de todas as amostras foiarmazenado a -20 ºC e uma alíquota foi reservada para determinar a concentração de proteína. Para aprecipitação de proteínas, foram adicionadas diferentes concentrações de sulfato de amônio. Foramrealizados SDS-PAGE e Western blot com anticorpo específico. Obtivemos a presença de BSP1. Foiobservada presença da proteína em todas as frações, porém, a fração 40-60% foi a que apresentou a maiorconcentração de BSP1, em média 98%. A técnica utilizada foi altamente eficaz e a purificação dessasproteínas possibilita uma melhoria na qualidade seminal in vitro e pode ser utilizada para obtenção deamostras altamente enriquecidas de BSPs, além de avaliar o potencial de fertilidade de reprodutores.(AU)

The objective of the present study was to partially purify binder of sperm protein 1 (BSP1)protein, a 15 kDa protein present in bovine vesicular gland fluids, by precipitation with ammoniumsulfate. Seminal fluid was extracted from the vesicular glands obtained from ten bos indicus bulls in acommercial slaughterhouse in Fortaleza, Ceará. The glands were transported and processed at theAnimal Physiology Laboratory of the Federal University of Ceará. A protease inhibitor cocktail wasused, with subsequent centrifugation. A pool of all samples was stored at -20 ° C and an aliquot was setaside to determine protein concentration. For protein precipitation, different concentrations ofammonium sulfate were added. SDS-PAGE and Western blot were performed with specific antibody. Weobtained the presence of BSP1. Protein presence was observed in all fractions, however, the 40-60%fraction presented the highest BSP1 concentration, on average 98%. The technique used was highlyeffective and the purification of these proteins allows an improvement in seminal quality in vitro and canbe used to obtain highly enriched samples of BSPs, besides evaluating the fertility potential of breeders.(AU)

Purificação de fração enriquecida de binder of sperm protein 1 (BSP 1) do fluido seminal bovino através da técnica de precipitação por sulfato de amônio / Purification of enriched fraction of binder of sperm protein 1 (BSP1) from bovine seminal fluid by ammonium sulphate precipitation technique

Objetivou-se no presente estudo realizar purificação parcial da proteína binder of sperm protein1 (BSP1), proteína de 15 kDa presente nos fluidos das glândulas vesiculares de bovinos, por meio deprecipitação com sulfato de amônio. O fluido seminal foi extraído das glândulas vesiculares obtidas dedez touros bos indicus em abatedouro comercial de Fortaleza, Ceará. As glândulas foram transportadas eprocessadas no Laboratório de Fisiologia Animal da Universidade Federal do Ceará. Foi utilizado umcoquetel inibidor de proteases, com posterior centrifugação. Um pool de todas as amostras foiarmazenado a -20 ºC e uma alíquota foi reservada para determinar a concentração de proteína. Para aprecipitação de proteínas, foram adicionadas diferentes concentrações de sulfato de amônio. Foramrealizados SDS-PAGE e Western blot com anticorpo específico. Obtivemos a presença de BSP1. Foiobservada presença da proteína em todas as frações, porém, a fração 40-60% foi a que apresentou a maiorconcentração de BSP1, em média 98%. A técnica utilizada foi altamente eficaz e a purificação dessasproteínas possibilita uma melhoria na qualidade seminal in vitro e pode ser utilizada para obtenção deamostras altamente enriquecidas de BSPs, além de avaliar o potencial de fertilidade de reprodutores.

The objective of the present study was to partially purify binder of sperm protein 1 (BSP1)protein, a 15 kDa protein present in bovine vesicular gland fluids, by precipitation with ammoniumsulfate. Seminal fluid was extracted from the vesicular glands obtained from ten bos indicus bulls in acommercial slaughterhouse in Fortaleza, Ceará. The glands were transported and processed at theAnimal Physiology Laboratory of the Federal University of Ceará. A protease inhibitor cocktail wasused, with subsequent centrifugation. A pool of all samples was stored at -20 ° C and an aliquot was setaside to determine protein concentration. For protein precipitation, different concentrations ofammonium sulfate were added. SDS-PAGE and Western blot were performed with specific antibody. Weobtained the presence of BSP1. Protein presence was observed in all fractions, however, the 40-60%fraction presented the highest BSP1 concentration, on average 98%. The technique used was highlyeffective and the purification of these proteins allows an improvement in seminal quality in vitro and canbe used to obtain highly enriched samples of BSPs, besides evaluating the fertility potential of breeders.

PURIFICAÇÃO PARCIAL DA BSP5 DO PLASMA SEMINAL BOVINO

O plasma seminal vem sendo objeto de várias pesquisas devido a sua importância na fisiologia espermática, ao qual a análise dos fluidos reprodutivos fornece informações cruciais para a compreensão dos mecanismos que determinam a capacidade fecundante dos gametas masculinos. Objetivou-se no presente estudo indicar um método para purificar a Binder of SPerm 5 (BSP5), proteína de 30 kDa presente no fluido das glândulas vesiculares de touros Bos indicus. O fluido seminal foi extraído das glândulas vesiculares obtidas em abatedouro, e posteriormente, submetido às cromatografias de afinidade à heparina (Hitrap Heparin HP) seguida pela cromatografia de troca iônica (SP Sepharose). Para o monitoramento da purificação, realizou-se SDS-PAGE e para confirmação das proteínas foi realizado western blot com anticorpo específico para BSP5. Baseado no perfil cromatográfico da heparina, foram observados dois picos bem definidos (nHBP e HBP), dos quais o pico referente às proteínas com afinidade pela heparina (HBP) representou percentual de 51,5% de proteínas do fluido das glândulas vesiculares. As HBPs, quando separadas por meio de cromatografia de troca-iônica, apresentaram seis picos agrupados em quatro frações cromatográficas (P1, P2, P3 e P4), dos quais os picos de proteínas ligantes (P3 e P4) totalizou 80,97%. O Western blot com anticorpo anti-BSP5 purificado a partir de anti-soro de coelho, confirmou a presença da banda de 30 kDa no fluido das glândulas vesiculares, no pico com afinidade à heparina e pico 4 da troca iônica. A partir dessa purificação parcial, foi observada que a sequência cromatográfica de afinidade pela heparina seguida de troca catiônica, é eficaz para capturar a BSP5. Contudo, faz-se necessário a ampliação desse método, seguido de confirmações através de sequenciamento recombinante e espectrometria de massas. E a partir dessa purificação é possível a realização de testes funcionais que permitem compreender os mecanismos pelos quais as proteínas BSPs modulam a capacitação espermática, além de incrementar processos biotecnológicos.

Seminal plasma has been the subject of several studies due to its importance in sperm physiology, which analysis of reproductive fluids provides crucial information for understanding the mechanisms that determine the fertile ability of male gametes. The objective of the present study was to indicate a method to purify the Binder of SPerm 5 (BSP5), a 30-kDa protein present in the vesicles gland fluid from Bos indicus bulls. The seminal fluid extracted from seminal vesicles glands was obtained in abattoir, and subsequently subjected to heparin affinity chromatography (Hitrap Heparin HP), followed by ion exchange chromatography (SP Sepharose). For the monitoring of purification, SDS-PAGE was performed and western blotting with BSP5-specific antibody was performed for protein confirmation. Based on heparin-binding proteins, it was observed two well-separated peaks (nHBP and HBP), which heparin-binding proteins (HBP) represented a percentage of 51.5% of seminal vesicle fluid proteins. HBPs, when separated by ion exchange chromatography, showed four peaks (P1, P2, P3 and P4), which the peaks of binding proteins (P3 and P4) represented 80.97%. Western blot with anti-BSP5 antibody purified from rabbit antiserum confirmed the presence of the 30-kDa band in seminal vesicle fluid, HBPs and ion exchange peak 4. From this partial purification, it was observed that heparin followed by ion exchange chromatographies are effective to capture the BSP5. However, it is necessary to extend this method, followed by confirmations through sequencing and mass spectrometry. Moreover, from this purification it is possible to perform functional tests that allow the understanding of the mechanism by which BSP proteins modulate the sperm capacitation, in addition to increasing biotechnological processes.