Resumo
ABSTRACT Escherichia coli is recognized as a frequent cause of diarrhea in swine. The objective of this study was to phenotypically characterize the fimbrial types of 349 E. coli strains isolated from swine with diarrhea, in different age groups, through the microhemagglutination and seroagglutination tests and to determine the susceptibility profile in regard to the more common antimicrobials used on pig farms. Of the 159 strains that not agglutinate eritrocytes in the manose-resistant hemagglutination test (HAMR), 57 (35%) were positive for the expression of the fimbrial antigen F6, in the fast seroagglutination test carried out in plates. Considering the age group and the fimbrial phenotype, the potentially pathogenic serotypes of E. coli more prevalent until the third week of age were: F5 (K99), F6 (987P), F42 and F41 in, respectively, 29%, 23%, 11% and 10% of the strains. In piglets over 21 days old, fimbriae F4 (K88) predominated in 44.6% (58) of the strains. The animals were susceptible to strains containing F4, in all of the age groups, but with more frequency at more advanced ages, above 76 days. The largest resistance indexes were observed for oxytetracycline (84.0%), gentamicin (76.0%) and amoxicilin (72.0%). The smallest CIM 50 and 90 values were observed for ceftiofur.
RESUMO Escherichia coli é reconhecida como causa freqüente de diarréia em suínos em todo o mundo. O objetivo do presente estudo foi caracterizar fenotipicamente os tipos fimbriais de 349 linhagens de E. coli isoladas de suínos com diarréia, em diferentes faixas etárias, utilizando os testes de microhemaglutinação e soroaglutinação, bem como determinar o perfil de suscetibilidade frente aos principais antimicrobianos utilizados em granjas de suínos. Do total de 159 linhagens de E. coli que não aglutinaram eritrócitos no teste de hemaglutinação manose-resistente (HAMR), 57 (35%) foram positivas para a expressão do antígeno fimbrial F6 no teste de soroaglutinação rápida em placa. Considerando a faixa etária e o fenótipo fimbrial, os sorotipos de E. coli, potencialmente patogênicos mais prevalentes até a terceira semana de idade, foram F5 (K99), F6 (987P), F42 e F41 em, respectivamente, 29%, 23%, 11% e 10% das linhagens. Em leitões com mais de 25 dias, predominaram fimbrias F4 (K88) em 44,6% (58) das linhagens. Os animais foram suscetíveis às cepas contendo F4, durante todas as faixas etárias, mas com maior predominância em idades mais avançadas, acima de 76 dias. Os maiores índices de resistência das linhagens foram observados para oxitetraciclina (84,0%), gentamicina (76,0 %) e amoxicilina (72,0%). Os menores valores de Concentração Inibitória Mínima (CIM) 50 e 90 foram observados para o ceftiofur.
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Since Mycoplasma hyopneumoniae isolation in appropriate media is a difficult task and impractical for daily routine diagnostics, Nested-PCR (N-PCR) techniques are currently used to improve the direct diagnostic sensitivity of Swine Enzootic Pneumonia. In a first experiment, this paper describes a N-PCR technique optimization based on three variables: different sampling sites, sample transport media, and DNA extraction methods, using eight pigs. Based on the optimization results, a second experiment was conducted for testing validity using 40 animals. In conclusion, the obtained results of the N-PCR optimization and validation allow us to recommend this test as a routine monitoring diagnostic method for Mycoplasma hyopneumoniae infection in swine herds.
A Nested-PCR (N-PCR) tem como objetivo melhorar a sensibilidade do diagnóstico direto da Pneumonia Enzoótica Suína, pois o isolamento do Mycoplasma hyopneumoniae é trabalhoso tornando-se inviável na rotina. Neste trabalho, foi realizado um projeto piloto para a otimização da técnica de N-PCR, utilizando três variáveis: tipo de amostra biológica, meio de transporte da amostra e método de extração do DNA, utilizando oito animais. Os resultados obtidos foram empregados no segundo experimento para a validação do teste utilizando 40 animais. Os resultados obtidos, pela otimização da N-PCR, neste trabalho, permite sugerir esta prova como método de diagnóstico de rotina no monitoramento das infecções por Mycoplasma hyopneumoniae em granjas de suínos.
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This paper describes the use of two antigens in ELISAs for the diagnosis of A. pleuropneumoniae (serotypes 3, 5 and 7) infections in Brazil. One antigen comprised the aqueous fraction obtained by phenol extraction from bacterial cultures (FAF) and the other was composed of long lipopolysaccharide chains (LPS-CL). Mono and polyvalent ELISA systems were standardized with the prevalent serotypes. Discriminating equations were developed with the ELISAs results obtained with two sets of serum samples. One set of sera had been collected from piglets free from A. pleuropneumoniae infections (known negative sera) and the other set collected from inoculated piglets after seroconversion (known positive sera). The results were compared using the generalized distance of Mahalanobis, the coefficient of determination, the F test, the global coefficient, the sensitivity, and the specificity. The results obtained with the FAF antigen were superior regarding all the evaluated parameters. However, the FAF-ELISA resulted in unexpected positive reactions with serum samples collected from animals that had been inoculated with heterologous serotypes (2 and 9). The sensitivity and the specificity of both tests ranged from 91.5 to 95.7, indicating that these two antigens are appropriate for use in A. pleuropneumoniae screening tests, as they can detect serotypes 3, 4, 5, 6, 7 and 8.
Compararam-se dois antígenos no teste de ELISA para o diagnóstico sorológico dos sorotipos 3, 5 e 7 de A. pleuropneumoniae prevalentes no Brasil. Um compunha-se da fase aquosa da extração fenólica de suspensão bacteriana (FAF) e o outro de lipopolissacarídeos de cadeia longa (LPS-CL). Com esses antígenos foram padronizados ELISAs monovalente e polivalente para os sorotipos prevalentes no Brasil. Com os resultados dos testes de um conjunto de amostras de soro de suínos livres de infecção para A. pleuropneumoniae e um conjunto de amostras de soro obtidas de leitões inoculados com os sorotipos citados e que apresentaram soroconversão, determinaram-se as equações discriminantes para os conjuntos de soros e compararam-se os testes quanto à distância generalizada de Mahalanobis, ao coeficiente de determinação, ao teste F, ao coeficiente global, à sensibilidade e à especificidade. Na análise desses parâmetros observou-se que o antígeno FAF foi superior. Com o ELISA PFAF reações positivas não esperadas foram observadas com animais inoculados com os sorotipos heterólogos 2 e 9, não observadas com o PLPS-CL. A sensibilidade dos testes polivalentes ficou entre 91,5 e 95,7% com especificidade similar, indicando que ambos os testes são adequados para triagem sorológica uma vez que detectam os sorotipos 3, 4, 5, 6, 7 e 8.
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Sera from piglets and sows from 10 positive and 10 negative herds to Actinobacillus pleuropneumoniae (App) were submitted to a polyvalent ELISA test based on long chain lipopolysaccharides (LC-LPS) against sorotypes 3, 5 and 7. Positive herds were those in which a strain of serotype 3, 5 or 7 was isolated and negative those ones in which there were neither notification of clinical symptoms, nor lesions of swine pleuropneumoniae, nor App isolation and all the herds were under veterinary control. All positive herds contained animals that seroconverted and the frequency of sows serologically positive was significantly higher than that of positive piglets. Four negative herds were serologically negative, but five herds had sows considered positive with high positive predictive values (96 to 99%) and one herd had a positive predictive value of 56%. The polyvalent ELISA LC-LPS to App serotypes 3, 5 and 7 had 100 % of sensibility but apparently low specificity. The sensibility of the polyvalent test and its capability of detecting the prevalent Brazilian serotypes and those with shared LPS antigens (3, 4, 5, 6, 7 e 8) indicates that this test might be used only as a screening test.
Um teste de ELISA polivalente baseado em lipopolissacarídeos de cadeia longa (LPS - CL) de Actinobacillus pleuropneumoniae (App) sorotipos 3, 5 e 7 foi avaliado testando-se amostras do soro de leitões e matrizes provenientes de 10 rebanhos positivos e de 10 rebanhos negativos. Foram classificados como positivos aqueles rebanhos com isolamento prévio do App sorotipos 3, 5 ou 7 e rebanhos negativos aqueles submetidos ao controle veterinário, sem notificação de sintomas clínicos, sem lesões de pleuropneumonia suína e sem isolamento do agente. Todos os rebanhos positivos apresentaram sorologia positiva e as matrizes apresentaram maior número de soroconversores (P 0,05) do que os leitões. Entre os rebanhos negativos quatro apresentaram sorologia negativa, cinco sorologia positiva com valores preditivos altos (96 a 99%) e um com valor preditivo considerado baixo (56%). O teste apresentou 100% de sensibilidade e aparentemente baixa especificidade, porém, como detectou os sorotipos prevalentes no Brasil e sorotipos que possuem LPS - CL homólogos (3, 4, 5, 6, 7 e 8), ele é aplicável somente como teste de triagem.
Resumo
Nasal and tonsil secretions and tonsil tissue were collected from 67 piglets (9-to-15 weeks old) from three positive herds and from 50 piglets from two negative herds. Positive herds were those in which an Actinobacillus pleuropneumoniae (App) strain of serotype 3, 5 or 7 was isolated and negative ones those in which there was no notification of clinical symptoms or lesions of swine pleuropneumoniae, no App isolation and the herd was under veterinarian control. The collected material was submitted to three different bacterial culture methods: 1- direct streak on solid selective medium, 2- dilution in selective broth followed by subculture in solid selective medium, and 3- dilution in selective broth medium followed by subculture in blood agar. Among the NAD-dependent strains recovered 86 were App, 13 belonged to the minor group and 21 to the Taxon group (C, D, E e F). From the positive herds four serotyped strains of App (sorotypes 3, 7 and 12) and 51 nonsorotipable strains were recovered. From the negative herds 31 nonsorotipable strains of App were recovered, indicating that App is a resident in the upper respiratory tract of pigs. The best method for recovering NAD-dependent strains from carrier piglets was achieved by direct culturing of tonsil tissue in solid selective medium (PPLO agar containing 2mu g of crystal violet, 10mu g of NAD, 1mu g of lincomycin, 1,4mu g of bacitracin per ml).
Secreções nasais, tonsilares e tecido tonsilar foram coletados de 67 leitões de 9 a 15 semanas de idade, provenientes de três rebanhos positivos para Actinobacillus pleuropneumoniae (App), e de 50 leitões provenientes de dois rebanhos negativos. Foram classificados como positivos aqueles rebanhos com isolamento prévio de sorotipos 3, 5 e 7 e rebanhos negativos aqueles submetidos a controle veterinário, sem notificação de sintomas clínicos, lesões de pleuropneumonia suína e sem isolamento do agente. O material coletado foi submetido a três diferentes métodos de cultivo: 1- semeadura direta em meio de cultivo sólido seletivo; 2- diluição em caldo seletivo seguido de subsemeadura em meio de cultivo sólido seletivo; 3- diluição em caldo seletivo seguido de subsemeadura em ágar sangue. Entre as amostras NAD-dependentes recuperadas 86 foram classificadas como App, 13 como grupo minor e 21 como grupo taxon (C, D, E e F). Dos rebanhos positivos foram recuperadas quatro amostras de App (sorotipos 3, 7 e 12) e 51 não sorotipificáveis. Dos rebanhos negativos foram recuperadas 31 amostras de App não sorotipificáveis, indicando que o App faz parte da flora normal do trato respiratório superior dos suínos. O melhor método de isolamento de amostras NAD-dependentes de leitões portadores foi da biópsia de tecido tonsilar semeado diretamente em meio sólido seletivo (PPLO ágar adicionado de 2mi g de cristal violeta, 10mi g NAD, 1mi g de lincomicina, 1,4mi g de bacitracina por ml).