Sperm-binding to the perivitelline membrane of chicken egg yolk as a functional test for sperm evaluation in dogs / Teste de ligação espermática à membrana perivitelínica da gema de ovo de galinha como avaliação funcional do sêmen de cães

During fertilization, spermatozoa interact with the zona pellucida (ZP) through the binding between the acrosome and proteins 2 and 3 (ZP2 and ZP3). The perivitelline membrane of chicken egg yolk is homologous to the mammalian ZP3, which allows the binding of sperm of several species. The aim of this study was to standardize and evaluate the efficiency of sperm-binding to the perivitelline membrane of chicken eggs as a functional method for canine semen evaluation. For this purpose, nine post-thaw sperm samples were used, which were divided into two aliquots: the first was kept in water bath at 37ºC (live sample) and the second was submitted to cold shock to induce cellular damage (dead sample). The two aliquots were mixed on five proportions, corresponding to 0%, 25%, 50%, 75%, and 100% of viable cells, and the binding test was performed by analyzing the number of spermatozoa bonded to the perivitelline membrane by means of computerized assessment of sperm motility (CASA) or conventional microscopy. Additionally, samples were submitted to sperm motility analysis, evaluation of plasmatic and acrosomal membrane integrity, and sperm mitochondrial activity. The sperm-binding test to the perivitelline membrane of chicken egg yolk was considered a feasible sperm analysis test for both fertilizing capacity and overall sperm attributes evaluation, mainly when the analysis is performed by a conventional microscope, which expands its practicality to the majority of canine reproduction laboratories.(AU)

Durante a fecundação, os espermatozoides interagem com a zona pelúcida (ZP) por meio da ligação entre o acrossomo e as proteínas 2 e 3 (ZP2 e ZP3). A membrana perivitelínica da gema de ovo de galinhas é homóloga à ZP3 de mamíferos, possibilitando a ligação espermática de diversas espécies. Este trabalho padronizou e avaliou a eficiência do teste de ligação espermática à membrana perivitelínica da gema de ovo de galinhas como avaliação funcional do sêmen de cães. Para tal, foram utilizadas nove amostras seminais previamente criopreservadas. Cada amostra foi dividida em duas alíquotas: a primeira foi mantida em banho-maria à 37ºC (vivos) e a segunda submetida a choque térmico com o intuito de induzir dano celular (mortos). As duas alíquotas foram misturadas, correspondendo a 0, 25, 50, 75 e 100% de células viáveis. As amostras foram avaliadas quanto ao número de espermatozoides ligados à membrana perivitelínica por meio da análise computadorizada da motilidade (CASA) ou microscopia convencional. Ademais, as amostras foram avaliadas quanto à motilidade espermática, integridade das membranas acrossomal e plasmática e atividade mitocondrial espermática. O teste de ligação espermática à membrana perivitelínica de ovos de galinha foi considerado um teste de análise seminal exequível tanto para avaliar a capacidade fecundante dos espermatozoides como atributos seminais gerais, especialmente quando realizado em microscopia convencional, expandindo sua praticidade para a maioria dos laboratórios de análise de sêmen canino.(AU)

Sperm-binding to the perivitelline membrane of chicken egg yolk as a functional test for sperm evaluation in dogs / Teste de ligação espermática à membrana perivitelínica da gema de ovo de galinha como avaliação funcional do sêmen de cães

During fertilization, spermatozoa interact with the zona pellucida (ZP) through the binding between the acrosome and proteins 2 and 3 (ZP2 and ZP3). The perivitelline membrane of chicken egg yolk is homologous to the mammalian ZP3, which allows the binding of sperm of several species. The aim of this study was to standardize and evaluate the efficiency of sperm-binding to the perivitelline membrane of chicken eggs as a functional method for canine semen evaluation. For this purpose, nine post-thaw sperm samples were used, which were divided into two aliquots: the first was kept in water bath at 37ºC (live sample) and the second was submitted to cold shock to induce cellular damage (dead sample). The two aliquots were mixed on five proportions, corresponding to 0%, 25%, 50%, 75%, and 100% of viable cells, and the binding test was performed by analyzing the number of spermatozoa bonded to the perivitelline membrane by means of computerized assessment of sperm motility (CASA) or conventional microscopy. Additionally, samples were submitted to sperm motility analysis, evaluation of plasmatic and acrosomal membrane integrity, and sperm mitochondrial activity. The sperm-binding test to the perivitelline membrane of chicken egg yolk was considered a feasible sperm analysis test for both fertilizing capacity and overall sperm attributes evaluation, mainly when the analysis is performed by a conventional microscope, which expands its practicality to the majority of canine reproduction laboratories.(AU)

Durante a fecundação, os espermatozoides interagem com a zona pelúcida (ZP) por meio da ligação entre o acrossomo e as proteínas 2 e 3 (ZP2 e ZP3). A membrana perivitelínica da gema de ovo de galinhas é homóloga à ZP3 de mamíferos, possibilitando a ligação espermática de diversas espécies. Este trabalho padronizou e avaliou a eficiência do teste de ligação espermática à membrana perivitelínica da gema de ovo de galinhas como avaliação funcional do sêmen de cães. Para tal, foram utilizadas nove amostras seminais previamente criopreservadas. Cada amostra foi dividida em duas alíquotas: a primeira foi mantida em banho-maria à 37ºC (vivos) e a segunda submetida a choque térmico com o intuito de induzir dano celular (mortos). As duas alíquotas foram misturadas, correspondendo a 0, 25, 50, 75 e 100% de células viáveis. As amostras foram avaliadas quanto ao número de espermatozoides ligados à membrana perivitelínica por meio da análise computadorizada da motilidade (CASA) ou microscopia convencional. Ademais, as amostras foram avaliadas quanto à motilidade espermática, integridade das membranas acrossomal e plasmática e atividade mitocondrial espermática. O teste de ligação espermática à membrana perivitelínica de ovos de galinha foi considerado um teste de análise seminal exequível tanto para avaliar a capacidade fecundante dos espermatozoides como atributos seminais gerais, especialmente quando realizado em microscopia convencional, expandindo sua praticidade para a maioria dos laboratórios de análise de sêmen canino.(AU)

Acute-phase protein profile of healthy bitches in diestrus: the influence of steroid hormones

Background: Acute-phase proteins are known as significant indicators of inflammation for several animal species, allowing more accurate follow-up of diseases, particularly when other clinical signs are not apparent. Nevertheless, the difficulty of data interpretation due to the absence of reference values for canine species represents an imperative obstacle for systematic clinical application. Moreover, no influence of hormonal status has yet been established for dogs. The aim of this study was thus to propose reference values of fibrinogen, haptoglobin, ceruloplasmin, seromucoid and glycoprotein for diestrous healthy females and therefore verify the influence of the hormone status.Materials, Methods & Results: Data consisted of weekly blood sampling from 20 Great Dane diestrous bitches during 9 weeks. Each animals health condition was verified through physical assessment and the absence of acute inflammatory or infectious processes was guaranteed by a total white cell count. Sampling started with diestrus onset and continued until the beginning of anestrus, evaluated by vaginal cytology. From blood samples, the concentrations of fibrinogen, haptoglobin, ceruloplasmin, seromucoid, glycoprotein, progesterone and estrogen were determined accordingly. No statistical variations (P < 0.05) on plasmatic fibrinogen, serum haptoglobin and ceruloplasmin concentrations were observed between weeks of diestrus nor a correlation between the hormonal profile. Significant increase in seromucoid concentration was verified between the 1st and 6th week of diestrus, while significant variation (P < 0.05) of glycoprotein was measured between the 1st and 3rd weeks of diestrus, as well as between weeks 2 and 9. The reference values proposed were: 182.22 (±46.40) mg/ dL for fibrinogen, 80.22 (±9.80) mg/dL of HbCN binding capacity for haptoglobin, 8.19 (±1.68) IU/L for ceruloplasmin, 79.88 (±15.78) mg/dL for seromucoid and 11.89 (±0.92) % for glycoprotein.[...](AU)

Acute-phase protein profile of healthy bitches in diestrus: the influence of steroid hormones

Background: Acute-phase proteins are known as significant indicators of inflammation for several animal species, allowing more accurate follow-up of diseases, particularly when other clinical signs are not apparent. Nevertheless, the difficulty of data interpretation due to the absence of reference values for canine species represents an imperative obstacle for systematic clinical application. Moreover, no influence of hormonal status has yet been established for dogs. The aim of this study was thus to propose reference values of fibrinogen, haptoglobin, ceruloplasmin, seromucoid and glycoprotein for diestrous healthy females and therefore verify the influence of the hormone status.Materials, Methods & Results: Data consisted of weekly blood sampling from 20 Great Dane diestrous bitches during 9 weeks. Each animal’s health condition was verified through physical assessment and the absence of acute inflammatory or infectious processes was guaranteed by a total white cell count. Sampling started with diestrus onset and continued until the beginning of anestrus, evaluated by vaginal cytology. From blood samples, the concentrations of fibrinogen, haptoglobin, ceruloplasmin, seromucoid, glycoprotein, progesterone and estrogen were determined accordingly. No statistical variations (P < 0.05) on plasmatic fibrinogen, serum haptoglobin and ceruloplasmin concentrations were observed between weeks of diestrus nor a correlation between the hormonal profile. Significant increase in seromucoid concentration was verified between the 1st and 6th week of diestrus, while significant variation (P < 0.05) of glycoprotein was measured between the 1st and 3rd weeks of diestrus, as well as between weeks 2 and 9. The reference values proposed were: 182.22 (±46.40) mg/ dL for fibrinogen, 80.22 (±9.80) mg/dL of HbCN binding capacity for haptoglobin, 8.19 (±1.68) IU/L for ceruloplasmin, 79.88 (±15.78) mg/dL for seromucoid and 11.89 (±0.92) % for glycoprotein.[...]

Avaliação clínica e hemodinâmica periparto de fêmeas bovinas da raça Holandesa em diferentes condições obstétricas / Peripartum clinical and hemodynamic evaluation of Holstein cows under distinct obstetric conditions

As distocias na espécie bovina são normalmente corrigidas por manobras obstétricas, sendo a extração forçada um procedimento obstétrico de risco, podendo causar injúrias tanto maternas quanto fetais. Partos induzidos com administração de ocitocina exógena nas inércias uterinas podem levar ao comprometimento fetal pela hipotensão e bradicardia materna, pois a ocitocina participa de regulações endócrinas e neuroendócrinas de órgãos como o coração e rins. O objetivo deste estudo foi comparar as mensurações de frequência cardíaca (FC), pressão arterial não-invasiva (PA) e eletrocardiograma de fêmeas bovinas da raça Holandesa agrupadas segundo a condição obstétrica: eutocia (G EUT; n = 10); distocia com manobra obstétrica (G DIST; n = 10); inércia uterina com infusão de ocitocina (G OCT; n = 10); nos seguintes momentos: pré-parto, intraparto, pós-parto imediato e uma hora após o parto. Os traçados eletrocardiográficos denotaram ritmo sinusal normal em todos os períodos. Observou-se taquicardia em todos os grupos, sendo que apenas no G OCT a FC pós-parto (111 ± 23 bpm) elevou-se estatisticamente em relação ao pré-parto (94 ± 11 bpm). Houve acréscimo significativo da PA no intraparto do G DIST (PA média = 101 ± 24 mmHg), decorrente de contrações uterinas e abdominais mais intensas. As fêmeas bovinas do Grupo OCT não apresentaram aumento significativo da PA diastólica intraparto em relação ao pré-parto como observado nos G EUT e G DIST. Os resultados apresentados demonstram que a distocia com correção manual eleva a pressão arterial das fêmeas bovinas, enquanto a administração de ocitocina altera momentaneamente as variáveis hemodinâmicas com possível efeito bradicárdico e hipotensor intraparto, impondo adaptação circulatória materna frente às alterações do parto. (AU)

Bovine dystocias are commonly assisted through obstetric procedures. However, manual traction delivery can be a dangerous strategy for the treatment of dystocia as it may lead to maternal and fetal injuries. Use of oxytocin for uterine atonia or hypotonia to induce contractions may compromise fetal welfare due to maternal hypotension and bradycardia, because this hormone regulates renal and heart endocrine and neuroendocrine actions. The aims of this study were to compare heart rate (HR) measurement, non-invasive blood pressure (BP) and electrocardiograms records of Holstein cows during the first stage of labour, intrapartum, immediately after calving and one hour later of physiological birth and dystocia. The animals were allocated in: group EUT eutocia (n = 10); group DYST dystocia with obstetric assistance (n = 10); group OCT uterine inertia treated with oxytocin (n = 10). The electrocardiograph tracing showed a normal sinus rhythm during all parturition. Tachycardia was observed in all groups, however, group OCT showed higher heart rate immediately after calving (111 ± 23 bpm) than prepartum evaluation (94 ± 11 bpm). During labor, DYST G presented significantly higher BP (Medium BP = 101 ± 24 mmHg), due to uterine and abdominal strengthened contractions. Group OCT cows didn't show significative elevation on diastolic BP during calving as occurred on EUT and DYST groups. The present results indicate superior blood pressure on manual traction delivery of bovine females, while oxytocin infusion altered transitorily hemodynamic variables with a possible bradicardiac effect and intrapartum hypotension and impose maternal circulatory adaptation during parturition. (AU)

Endocrinologia da gestação e parto em cadelas / Endocrinology of pregnancy and parturition in bitches

Os mecanismos relacionados ao controle endócrino do período gestacional e parto em cadelas ainda não estão totalmente elucidados. Desta maneira, a presente compilação de trabalhos científicos referentes aos principais eventos durante a gestação e o parto em cadelas tem por escopo a atualização sobre a endocrinologia em tais eventos fisiológicos e a divulgação sumariada dos conhecimentos gerados a partir das pesquisas científicas na área. É de conhecimento comum que a síntese e a secreção da progesterona, originária principalmente do corpo lúteo, são de extrema importância para manutenção e conseqüente progresso da gestação. Ainda, os níveis plasmáticos desse hormônio podem ser utilizados como método para predizer o momento do parto na espécie canina. Adicionalmente, a relaxina é detectada somente em cadelas gestantes, portanto sua detecção pode ser considerada um método de diagnóstico de gestação. Durante a segunda fase da gestação, observa-se liberação pulsátil de prolactina, simultaneamente ao aumento dos níveis de estrógeno. Entretanto, a influência do estrógeno no mecanismo de secreção de prolactina ainda é incerta. Por outro lado, ao final da gestação, evidencia-se queda dos níveis de progesterona e aumento dos níveis séricos de estrógeno, decorrente principalmente da ação do cortisol fetal. Tais eventos, associados à liberação de PGF2α pelo útero, culminam com o início do parto. O aumento das contrações uterinas e a expulsão fetal ocorrem principalmente pela ação da ocitocina. Entretanto, a ação desse hormônio não requer necessariamente o aumento das concentrações plasmáticas, sugerindo haver uma ação autócrina ou parácrina da ocitocina em cadelas. Embora os estudos relacionados à endocrinologia da gestação e do parto em cadelas tenham elucidado diversas interações e padrões hormonais, tais processos ainda não estão totalmente descritos, uma vez que as cadelas apresentam particularidades reprodutivas que as diferem das demais espécies. Neste particular sentido, futuras pesquisas devem ser conduzidas para contribuir com o conhecimento técnico-científico nesta espécie.(AU)

The mechanisms related to the endocrine control of pregnancy and parturition in bitches are still unknown. Thus, this compilation of scientific articles referred to canine pregnancy and parturition aims to update on the endocrinology of the main physiological events and to disclose in a summarized manner the knowledge generated from scientific research. It is known that the synthesis and secretion of progesterone mainly originated from the corpus luteum are of utmost importance for pregnancy maintenance. In addition, plasma levels of this hormone can be employed as a method to predict the onset of parturition in bitches. Moreover, relaxine is present only in pregnant bitches; therefore its serum determination can be considered as pregnancy diagnostic method. During midgestation, it is observed a pulsatile release of prolactin simultaneously to increased levels of estrogen. However, the influence of estrogen on the mechanism of prolactin secretion remains unknown. On the other hand, decreased levels of progesterone and increased concentrations of estrogen are observed at the end of pregnancy, as a consequence of enhanced fetal cortisol synthesis. These events in association to the release of uterine PGF2α trigger the onset of labor. The increase in uterine contractions and fetal expulsion occur mainly as an oxytocin influence. However, the action of this hormone does not necessarily require the increase in plasma concentrations, suggesting an autocrine or paracrine mechanism of action in bitches. Although studies related to canine endocrinology of pregnancy and parturition have clarified several hormonal interactions and patterns, these mechanism are not fully described, as the bitches have reproductive characteristics that differ from other species. Additional research should be undertaken in order to improve technical and scientific knowledge in this species.(AU)

Endocrinologia da gestação e parto em cadelas / Endocrinology of pregnancy and parturition in bitches

Os mecanismos relacionados ao controle endócrino do período gestacional e parto em cadelas ainda não estão totalmente elucidados. Desta maneira, a presente compilação de trabalhos científicos referentes aos principais eventos durante a gestação e o parto em cadelas tem por escopo a atualização sobre a endocrinologia em tais eventos fisiológicos e a divulgação sumariada dos conhecimentos gerados a partir das pesquisas científicas na área. É de conhecimento comum que a síntese e a secreção da progesterona, originária principalmente do corpo lúteo, são de extrema importância para manutenção e conseqüente progresso da gestação. Ainda, os níveis plasmáticos desse hormônio podem ser utilizados como método para predizer o momento do parto na espécie canina. Adicionalmente, a relaxina é detectada somente em cadelas gestantes, portanto sua detecção pode ser considerada um método de diagnóstico de gestação. Durante a segunda fase da gestação, observa-se liberação pulsátil de prolactina, simultaneamente ao aumento dos níveis de estrógeno. Entretanto, a influência do estrógeno no mecanismo de secreção de prolactina ainda é incerta. Por outro lado, ao final da gestação, evidencia-se queda dos níveis de progesterona e aumento dos níveis séricos de estrógeno, decorrente principalmente da ação do cortisol fetal. Tais eventos, associados à liberação de PGF2α pelo útero, culminam com o início do parto. O aumento das contrações uterinas e a expulsão fetal ocorrem principalmente pela ação da ocitocina. Entretanto, a ação desse hormônio não requer necessariamente o aumento das concentrações plasmáticas, sugerindo haver uma ação autócrina ou parácrina da ocitocina em cadelas. Embora os estudos relacionados à endocrinologia da gestação e do parto em cadelas tenham elucidado diversas interações e padrões hormonais, tais processos ainda não estão totalmente descritos, uma vez que as cadelas apresentam particularidades reprodutivas que as diferem das demais espécies. Neste particular sentido, futuras pesquisas devem ser conduzidas para contribuir com o conhecimento técnico-científico nesta espécie.

The mechanisms related to the endocrine control of pregnancy and parturition in bitches are still unknown. Thus, this compilation of scientific articles referred to canine pregnancy and parturition aims to update on the endocrinology of the main physiological events and to disclose in a summarized manner the knowledge generated from scientific research. It is known that the synthesis and secretion of progesterone mainly originated from the corpus luteum are of utmost importance for pregnancy maintenance. In addition, plasma levels of this hormone can be employed as a method to predict the onset of parturition in bitches. Moreover, relaxine is present only in pregnant bitches; therefore its serum determination can be considered as pregnancy diagnostic method. During midgestation, it is observed a pulsatile release of prolactin simultaneously to increased levels of estrogen. However, the influence of estrogen on the mechanism of prolactin secretion remains unknown. On the other hand, decreased levels of progesterone and increased concentrations of estrogen are observed at the end of pregnancy, as a consequence of enhanced fetal cortisol synthesis. These events in association to the release of uterine PGF2α trigger the onset of labor. The increase in uterine contractions and fetal expulsion occur mainly as an oxytocin influence. However, the action of this hormone does not necessarily require the increase in plasma concentrations, suggesting an autocrine or paracrine mechanism of action in bitches. Although studies related to canine endocrinology of pregnancy and parturition have clarified several hormonal interactions and patterns, these mechanism are not fully described, as the bitches have reproductive characteristics that differ from other species. Additional research should be undertaken in order to improve technical and scientific knowledge in this species.

Efeito da glutationa reduzida (GSH) na criopreservação de espermatozóides da espécie canina: avaliação in vitro e in vivo / Effect of reduced glutathione (GSH) in the cryopreservation of canine spermatozoa: in vitro and in vivo evaluation

O presente experimento teve por objetivos comparar a adição de diferentes concentrações de glutationa reduzida (GSH) no diluidor para criopreservação do sêmen de cães, considerando-se as características morfofuncionais pós-descongelação; e verificar os índices de gestação e número de filhotes por ninhada obtidos a partir da inseminação artificial intra-uterina, por cateterização cervical endoscópica, com sêmen criopreservado contendo diferentes concentrações de glutationa. Na primeira fase do experimento, foram realizadas duas colheitas seminais de 11 reprodutores com intervalo mínimo de uma semana entre os procedimentos. Foram empregadas três concentrações diferentes de glutationa reduzida (0, 10 e 20 mM) ao meio de congelação tris-gema-citrato. O sêmen fresco, refrigerado, glicerolizado e descongelado foram avaliados por citometria de fluxo com uso de sondas específicas para determinar a integridade das membranas plasmática e acrossomal, potencial de membrana mitocondrial e fragmentação de DNA. Também foi realizada dosagem de substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS) para avaliar os níveis de estresse oxidativo. Na segunda fase do experimento, foram inseminadas 6 fêmeas, alocadas em dois grupos: inseminação intra-uterina com sêmen congelado em diluidor contendo 10 mM (IA-GSH10, n=3) e sem a adição de glutationa (IA-GSH0, n=3). O acompanhamento do ciclo estral foi realizado por citologia vaginal, vaginoscopia, dosagem de progesterona e LH. Foram realizadas duas inseminações no 5o e 6o dias após pico de LH e a gestação diagnosticada aos 30 dias. A adição de 10 e 20 mM de GSH ao diluidor para criopreservação promoveu queda na motilidade espermática nas amostras descongeladas, sendo o maior prejuízo observado na concentração de 20 mM. Foi detectada maior porcentagem de acrossomos íntegros nos grupos tratados. A glicerolização e, principalmente, a exposição do espermatozóide ao nitrogênio líquido e posterior descongelação foram responsáveis pela diminuição da motilidade espermática, em consequência ao prejuízo da função mitocondrial promovida pela produção de radicais livres durante o processamento seminal. A gestação foi diagnosticada em duas fêmeas do grupo IA-GSH10 e duas do grupo IA-GSH0. Em conclusão, a adição de 10 e 20 mM de GSH ao diluidor para criopreservação seminal não promoveu os efeitos protetores esperados na espécie canina, sendo a concentração de 20 mM responsável por maiores prejuízos à amostra seminal. A adição de 10 mM de GSH ao diluidor para criopreservação seminal na espécie canina manteve o índice de fertilidade semelhante ao obtido com sêmen criopreservado sem a suplementação antioxidante

The present experiment aimed to compare the addition of different concentrations of reduced glutathione (GSH) on frozen-thawed canine semen, considering the morphofunctional characteristics; and to verify the pregnancy rate and number of puppies per litter obtained from intrauterine insemination by endoscopic catheterization of the cervix, with frozen-thawed semen containing different concentrations of glutathione. During the first phase of the experiment, two seminal samples collected weekly from 11 mature dogs were used. Three different concentrations of reduced glutathione (0, 10 and 20 mM) were supplemented in a tris-citrate egg yolk extender. The fresh, chilled, glycerolized and post-thawed semen were assessed by flow cytometry using specific probes to determine plasma membrane and acrosomal integrity, mitochondrial membrane potential and DNA fragmentation. Thiobarbituric acid reactive substances (TBARS) assay was also performed to assess the occurrence of oxidative stress. In the second phase of the experiment, six canine females were allocated into two groups: intrauterine insemination with frozen-thawed semen containing 10 mM GSH (IA-GSH10, n = 3) and without the addition of glutathione (IA-GSH0, n = 3). Bitches were monitored by vaginal cytology, vaginoscopy, progesterone and LH assays. Two inseminations were performed on days 5 and 6 post LH peak. We verified that the addition of 10 and 20 mM of GSH to semen extender promoted a decrease in post-thaw sperm motility, as well as a higher damage degree at the 20 mM concentration. We also detected a higher percentage of acrossomal integrity in treated groups. At glycerolization and moreover, the sperm exposure to liquid nitrogen and further thawing, were responsible for the decrease in sperm motility, due to the loss of mitochondrial function through the free radicals production. Gestation was diagnosed in two female from IA-GSH10 group and two bitches of the IA-GSH0 group. In conclusion, we did not observe the expected protective effects of the addition of 10 and 20 mM GSH to semen extender. Furthermore, the concentration of 20 mM was responsible for the more extreme damage to semen sample. The supplementation of 10 mM GSH to semen extender for cryopreservation maintained the fertility rates similar to the ones observed for cryopreservation without antioxidant supplementation in dogs

Efeito da glutationa reduzida (GSH) na criopreservação de espermatozóides da espécie canina: avaliação in vitro e in vivo / Effect of reduced glutathione (GSH) in the cryopreservation of canine spermatozoa: in vitro and in vivo evaluation

O presente experimento teve por objetivos comparar a adição de diferentes concentrações de glutationa reduzida (GSH) no diluidor para criopreservação do sêmen de cães, considerando-se as características morfofuncionais pós-descongelação; e verificar os índices de gestação e número de filhotes por ninhada obtidos a partir da inseminação artificial intra-uterina, por cateterização cervical endoscópica, com sêmen criopreservado contendo diferentes concentrações de glutationa. Na primeira fase do experimento, foram realizadas duas colheitas seminais de 11 reprodutores com intervalo mínimo de uma semana entre os procedimentos. Foram empregadas três concentrações diferentes de glutationa reduzida (0, 10 e 20 mM) ao meio de congelação tris-gema-citrato. O sêmen fresco, refrigerado, glicerolizado e descongelado foram avaliados por citometria de fluxo com uso de sondas específicas para determinar a integridade das membranas plasmática e acrossomal, potencial de membrana mitocondrial e fragmentação de DNA. Também foi realizada dosagem de substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS) para avaliar os níveis de estresse oxidativo. Na segunda fase do experimento, foram inseminadas 6 fêmeas, alocadas em dois grupos: inseminação intra-uterina com sêmen congelado em diluidor contendo 10 mM (IA-GSH10, n=3) e sem a adição de glutationa (IA-GSH0, n=3). O acompanhamento do ciclo estral foi realizado por citologia vaginal, vaginoscopia, dosagem de progesterona e LH. Foram realizadas duas inseminações no 5o e 6o dias após pico de LH e a gestação diagnosticada aos 30 dias. A adição de 10 e 20 mM de GSH ao diluidor para criopreservação promoveu queda na motilidade espermática nas amostras descongeladas, sendo o maior prejuízo observado na concentração de 20 mM. Foi detectada maior porcentagem de acrossomos íntegros nos grupos tratados. A glicerolização e, principalmente, a exposição do espermatozóide ao nitrogênio líquido e posterior descongelação foram responsáveis pela diminuição da motilidade espermática, em consequência ao prejuízo da função mitocondrial promovida pela produção de radicais livres durante o processamento seminal. A gestação foi diagnosticada em duas fêmeas do grupo IA-GSH10 e duas do grupo IA-GSH0. Em conclusão, a adição de 10 e 20 mM de GSH ao diluidor para criopreservação seminal não promoveu os efeitos protetores esperados na espécie canina, sendo a concentração de 20 mM responsável por maiores prejuízos à amostra seminal. A adição de 10 mM de GSH ao diluidor para criopreservação seminal na espécie canina manteve o índice de fertilidade semelhante ao obtido com sêmen criopreservado sem a suplementação antioxidante (AU)

The present experiment aimed to compare the addition of different concentrations of reduced glutathione (GSH) on frozen-thawed canine semen, considering the morphofunctional characteristics; and to verify the pregnancy rate and number of puppies per litter obtained from intrauterine insemination by endoscopic catheterization of the cervix, with frozen-thawed semen containing different concentrations of glutathione. During the first phase of the experiment, two seminal samples collected weekly from 11 mature dogs were used. Three different concentrations of reduced glutathione (0, 10 and 20 mM) were supplemented in a tris-citrate egg yolk extender. The fresh, chilled, glycerolized and post-thawed semen were assessed by flow cytometry using specific probes to determine plasma membrane and acrosomal integrity, mitochondrial membrane potential and DNA fragmentation. Thiobarbituric acid reactive substances (TBARS) assay was also performed to assess the occurrence of oxidative stress. In the second phase of the experiment, six canine females were allocated into two groups: intrauterine insemination with frozen-thawed semen containing 10 mM GSH (IA-GSH10, n = 3) and without the addition of glutathione (IA-GSH0, n = 3). Bitches were monitored by vaginal cytology, vaginoscopy, progesterone and LH assays. Two inseminations were performed on days 5 and 6 post LH peak. We verified that the addition of 10 and 20 mM of GSH to semen extender promoted a decrease in post-thaw sperm motility, as well as a higher damage degree at the 20 mM concentration. We also detected a higher percentage of acrossomal integrity in treated groups. At glycerolization and moreover, the sperm exposure to liquid nitrogen and further thawing, were responsible for the decrease in sperm motility, due to the loss of mitochondrial function through the free radicals production. Gestation was diagnosed in two female from IA-GSH10 group and two bitches of the IA-GSH0 group. In conclusion, we did not observe the expected protective effects of the addition of 10 and 20 mM GSH to semen extender. Furthermore, the concentration of 20 mM was responsible for the more extreme damage to semen sample. The supplementation of 10 mM GSH to semen extender for cryopreservation maintained the fertility rates similar to the ones observed for cryopreservation without antioxidant supplementation in dogs (AU)

Influência das condições obstétricas ao nascimento sobre padrões de vitalidade e bioquímica neonatal na espécie canina / Canine neonatal vitality and biochemistry profile under distinct obstetric conditions

Em Medicina Veterinária, os avanços em Neonatologia são escassos quando comparados aos da Medicina Humana. Dentre as possíveis causas para esta situação atual destacam-se as particularidades fisiológicas deste período. Os objetivos do presente estudo foram: estabelecer os valores normais de algumas variáveis laboratoriais de neonatos nascidos de parto eutócico, identificar eventuais alterações metabólicas maternas e dos neonatos nascidos em diferentes condições obstétricas, verificar os efeitos da administração de ocitocina sob variáveis neonatais e maternas e mensurar os níveis de cortisol materno e neonatal como forma de estudar as diferentes situações de estresse no momento do parto. Vinte e nove fêmeas caninas foram alocadas em 3 grupos, de acordo com o tipo de parto: eutocia (grupo 1), distocia corrigida por manobras obstétricas ou cesariana (grupo 2) e indução de contrações uterinas com ocitocina (grupo 3). Cinqüenta e um neonatos foram avaliados por meio do sistema Apgar e temperatura corpórea ao nascimento, 5 minutos e 1 hora após o nascimento, bem como por avaliação hemogasométrica, dosagem de cortisol e glicemia ao nascimento e após 1 hora. A avaliação materna constituiu no controle da pressão arterial, monitorização cardíaca, glicemia e dosagem de cortisol em momentos pontuais no pré, intra e pós-parto. Os neonatos dos distintos grupos apresentaram acidose mista associada à hipóxia ao nascimento, com maior comprometimento metabólico nos filhotes do grupo 3. Após 1 hora, recuperaram-se do componente respiratório, mantendo apenas o quadro de acidose metabólica por maior comprometimento da hipóxia. A avaliação neonatal pelo escore Apgar demonstrou que filhotes do grupo 2 nascem em maior depressão que neonatos dos grupos 1 e 3, porém todos apresentam adequada recuperação após 1 hora. Nas parturientes, a administração de ocitocina favoreceu a elevação da pressão arterial para níveis normais durante o trabalho de parto, bem como o aumento da glicemia. Neonatos nascidos por manobra obstétrica ou cesariana apresentaram maior concentração de cortisol plasmático ao nascimento, em comparação aos grupos 1 e 3. Contudo, todos os neonatos apresentaram redução significativa dos níveis de cortisol após 1 hora do nascimento. Por outro lado, foi possível verificar maior concentração sérica deste hormônio após o término do parto nas fêmeas submetidas à infusão de ocitocina. Em conclusão, a administração de ocitocina é responsável por maiores alterações metabólicas em neonatos; na parturiente, a administração de ocitocina promove alterações na pressão arterial, glicemia e aumento da liberação de cortisol; a manobra obstétrica ou cesariana promove maior estresse neonatal ao nascimento

Studies accomplishing canine neonatology are scarce in Veterinary Medicine comparing to Human Neonatology due to the particularity of this refered period. The aims of the present study were to establish standard laboratorial values of the canine neonate, identify metabolic changes of bitches and neonates born under different obstetric conditionsl, verify the consequences of dystocia treated medically by oxytocin administration on maternal and neonatal variables and to measure maternal and neonatal cortisol levels on distinc stress situations during parturition. Twenty nine canine females were allocated into 3 groups according to the obstetric conditions: eutocia (group 1; n=10), manipulative obstetric assistance or cesarean section (group 2; n=10) and maternal dystocia treated with oxytocin (group 3; n=9). Fifty one neonates were submitted to a clinical evaluation by Apgar scoring and body temperature measurement immediately after birth, at 5 and 60 minutes postnatal; and hemogasometric evaluation, blood glucose and cortisol assay immediately after birth and 60 minutes postnatal. Maternal noninvasive arterial blood pressure, blood glucose and cardiac monitoring were peformed during the first stage of labor, intra-partum, immediately after the last puppy was born and 1 hour later. Neonates from distinct groups showed mixed acidosis in addition to hypoxemia at birth. Neonates remained under metabolic acidosis even after 1 hour of birth due to a detrimental effect on hypoxia. Comparing the results among groups, puppies from group 2 showed significantly lower Apgar score at birth. However, 1 hour later all neonates showed full recovery. Dams subjected to oxytocin infusion showed an increase in blood pressure, hence switching to a normotension status and also presented higher glucose level during parturition. Manipulative obstetric assistance or cesarean section arised neonatal cortisol levels at birth. However, all neonates exhibited significantly lower cortisol concentration after 1 hour of birth. Bitches of group 3 showed significantly higher cortisol level immediatly after whelping. In conclusion, dystocia treated medically by oxytocin infusion resulted in more intense metabolic alterations compared to neonates born under eutocia; oxytocin administration promotes blood pressure enhance, glucose alterations and increase in maternal stress; manipulative obstetric assistance or cesarean section increased neonatal cortisol release at birth