Resumo
Calotropis procera (Ait.) R. Br. é uma planta laticífera da família Apocynaceae, conhecida popularmente na Região Nordeste do Brasil como algodão de seda, flor de seda e queimadeira. O látex de C. procera é rico em proteínas e há evidências de que algumas estejam envolvidas com propriedades anti-inflamatórias observadas em diferentes modelos experimentais. Anteriormente, foi isolada do látex de C. procera uma osmotina nomeada como CpOsm. Osmotinas são proteínas que possuem semelhança estrutural e funcional à adiponectina humana, uma adipocina endógena que exibe efeitos anti-inflamatórios. O presente estudo investigou a hipótese de que uma Osmotina recombinante de C. procera (rCpOsm) obtida através de linhagem de E. coli transformada seria capaz de prevenir o desenvolvimento de um processo inflamatório derivado de uma infecção microbiana sistêmica. CalotropisComo modelo de infecção foi utilizado um isolado clínico de Listeria monocytogenes (cepa 619). Esta espécie é associada a infecções de origem alimentar que acometem animais e seres humanos provocando, dentre outros quadros, abortos e miningoencefalite. Inicialmente, foram realizados ensaios com culturas celulares de macrófagos peritoneais (pMØ) obtidas de camundongos Swiss. rCpOsm foi testada em relação à citotoxicidade em concentrações que variaram entre 6,25 e 400 g / mL. Concentrações não tóxicas de rCpOsm (1 e 10 g / mL) foram utilizadas nos tratamentos de pMØ, seguido de infecção por L. monocytogenes. Foi observado que os tratamentos com rCpOsm reduziram a carga bacteriana intracelular e aumentaram a viabilidade de pMØ infectados em comparação ao grupo sem tratamento, apesar da proteína não inibir o crescimento direto de L. monocytogenes in vitro. Nos grupos tratados, foi observada redução na produção de transcritos de mRNA para as citocinas IL-10 e TNF- e aumento na expressão das citocinas IL-1 e IL-6. A administração endovenosa de rCpOsm em camundongos Swiss foi capaz de diminuir significativamente a infiltração de leucócitos na cavidade peritoneal após inóculo de L. monocytogenes, via intraperitoneal. A quantificação de bactérias viáveis no fluido peritoneal e fígado dos animais tratados com rCpOsm foi superior nos animais que não receberam tratamento. A produção de transcritos de mRNA da citocina anti-inflamatória IL-10 no baço dos animais infectados foi aumentada com os tratamentos com rCpOsm. Dados histológicos mostraram que as concentrações de rCpOsm utilizadas não foram tóxicas ao tecido esplênico e hepático dos camundongos, alémda rCpOsm minimizar os danos no tecido hepático durante a fase aguda, após inoculação de L. monocytogenes. Tomados juntos, os resultados mostraram que rCpOsm foi capaz de prevenir um processo inflamatório grave derivado de uma infecção real, causada por L. monocytogenes, diminuindo também o dano histológico em órgão alvo da infecção. Esses dados são discutidos à luz da literatura.
Calotropis procera (Ait.) R. Br. is a laticifer plant from the Apocynaceae family popularly known as silk cotton, silk flower and burner in Brazil´s Northeast. C. procera latex is rich in proteins and there is evidence that some harbor anti-inflammatory properties reported with different experimental models. Previously, an osmotin named CpOsm was isolated from the latex of C. procera. Osmotins are proteins that have a structural and functional similarity to human adiponectin, an endogenous adipokine that exhibits anti-inflammatory actions. The present study investigated the hypothesis that a recombinant C. procera Osmotin (rCpOsm) obtained from a transformed E. coli strain would be able to prevent the development of an inflammatory process derived from a systemic microbial infection. As a model of infection, a clinical isolate of Listeria monocytogenes (strain 619) was used. This species is associated with food-borne infections that affect animals and humans, causing, among, abortions and miningoencephalitis. Firstlly, assays were performed with peritoneal macrophage cell cultures (pMØ) from Swiss mice. rCpOsm was tested for cytotoxicity at concentrations ranging from 6.25 and 400 g / mL. Non-toxic concentrations of rCpOsm (1 and 10 g / mL) were used in pMØ treatments, followed by infection with L. monocytogenes. Despite the fact that rCpOsm does not inhibit the growth of L. monocytogenes in vitro, protein treatments reduced the intracellular bacterial load and increased the viability of infected pMØ compared to the untreated group. It was observed a reduction in the level of mRNA transcripts for the cytokines IL-10 and TNF- and an increase in the expression of cytokines IL-1 and IL-6 in rCpOsm-treated groups. The intravenous administration of rCpOsm to Swiss mice significantly decrease the infiltration of leukocytes in the peritoneal cavity after inoculation of L. monocytogenes, intraperitoneally. Quantification of viable bacteria in the peritoneal fluid and liver of animals treated with rCpOsm was higher in comparison to animals that did not receive treatment. The production of mRNA transcripts for the anti-inflammatory cytokine IL-10 in the spleen of infected animals was increased with rCpOsm treatments. Histological data showed that the rCpOsm was not toxic to the splenic and hepatic tissue of the mice, and they also minimized damages to the liver tissue during the acute phase of L. monocytogenes after inoculation. Taken together, the results showed that rCpOsm was able to prevent a serious inflammatory process derived from a real infection, caused by L. monocytogenes, also decreasing the damage to target organs of infection. These data are discussed in the light of the literature.
Resumo
Calotropis procera, planta medicinal conhecida popularmente em Pernambuco como algodão-de-seda. É uma planta laticífera que pertence à família Apocynaceae, sendo encontrada com facilidade no nordeste brasileiro. Dados da literatura corrente mostram que proteínas obtidas de seu látex possuem ação anti-inflamatória. Diante disso, neste trabalho, uma fração proteica obtida por cromatografia de troca iônica, chamada LPPII, rica em proteases cisteínicas, foi avaliada quanto à sua atividade imunomodulatória em culturas de macrófagos peritoneais infectadas por Salmonella enterica Sor. Typhimurium. Os macrófagos foram obtidos a partir da lavagem peritoneal de camundongos Swiss com meio de cultura RPMI contendo antibióticos penicilina e estreptomicina. As células do fluido obtido foram ajustadas a 1 x 106 cél/ mL e incubadas em estufa a 37ºC e CO2 5%, em placas de cultura de células, e os macrófagos aderentes utilizados nos ensaios. Os ensaios de quantificação bacteriana se deram de forma preventiva, onde os macrófagos foram tratados com LPPII (1 g/mL ou 10 g/mL) ou LPPII+IAA (10 g/mL) (inativada com iodoacetamida) seguido de infecção com S. Typhimurium (1 x 108 UFC/mL), e de forma curativa, onde primeiro se deu infecção dos macrófagos por S. Typhimurium (1 x 108 UFC/mL) seguido de tratamento com LPPII (1 g/mL ou 10 g/mL) ou LPPII+IAA (10 g/mL). O ensaio de viabilidade celular foi realizado de forma curativa com macrófagos infectados com S. Typhimurium (1 x 108 UFC/mL). Para ensaios de expressão gênica de citocinas IL1- , TNF, IL-6, iNOS e TLR-4, os macrófagos receberam apenas tratamento com LPPII (1 g/mL ou 10 g/mL) ou LP+IAA (10 g/mL), ou houve estímulo de LPS bacteriano, seguidos de tratamentos de forma curativa ou preventiva com LPPII (1 g/mL ou 10 g/mL) ou LP+IAA (10 g/mL). Os resultados mostram que macrófagos infectados com uma cepa de S. Typhimurium C5 e tratados com LPPII de forma preventiva ou curativa, reduziram o número de bactérias viáveis no ambiente intracelular. Neste caso, macrófagos tratados de forma preventiva com LPPII 10 g/mL, demonstraram diminuição significativa (p<0,05) na quantidade de bactérias intracelulares quando comparados ao controle, macrófagos sem tratamento com LPPII. Na forma curativa, observou-se diminuição significativa de S. Typhimurium intracelular em macrófagos tratados com LPPII1g/mL, quando comparados ao controle, células sem tratamento com LPPII. Por outro lado, os grupos tratados com LPPII+IAA tiveram um maior número de bactérias intracelulares, sugerindo a ação das proteases cisteínicas no efeito antimicrobiano observado. O tratamento curativo com LPPII também aumentou a viabilidade dos macrófagos infectados em relação aos grupos controles sem tratamento. Deste modo, grupos tratados com LPPII1g/mL obtiveram viabilidade 14,74% maior que o grupo controle sem tratamento, enquanto que macrófagos tratados com LPPII10g/mL obtiveram 24,11%. Grupos de macrófagos estimulados com LPS e, a seguir, tratados com LPPII, tiveram redução na expressão gênica das citocinas inflamatórias TNF, IL1- e IL-6, além de receptor do tipo Toll-4. Tomados esses resultados em conjunto, observamos que LPPII obtida do látex de C. procera apresenta biomoléculas com atividade imunomodulatória benéfica ao controle de infecções por S. Typhimurium.
Calotropis procera, is a medicinal plant known in Pernambuco as silk-cotton. Is laticífer plant belonging to the family Apocynaceae broadly found in the Brazilian Northeast. Current literature data show that proteins obtained from its latex harbour anti-inflammatory action. In the present study, a protein fraction obtained by ion-exchange chromatography named LPPII, which is rich in cysteine proteases, had its immunmodulatory activity evaluated in cultures of peritoneal macrophages infected by Salmonella enterica Sor. Typhimurium. Macrophages were obtained from the peritoneal cavity of Swiss mice using RPMI culture medium containing antibiotics. The cells obtained were adjusted to 1 x 106 cell/mL and incubated at 37° C and 5% CO2, in cell culture plates, and the adherent macrophages used in the assays. The bacterial quantification assays were performed in a preventive manner, where the macrophages were treated with LPPII (1 g/ mL or 10 g/ mL) or LPPII+IAA (10 g / mL) (inactivated with iodoacetamide) followed by infection with S. Typhimurium (1 x 108 CFU / mL), and in a curative manner, where macrophages were first infected with S. typhimurium (1 x 108 CFU / mL) followed by treatment with LPPII (1 g/ mL or 10 g/ mL) or LPPII+IAA (10 g/ ml). The cell viability assay was performed curatively with macrophages infected with S. Typhimurium (1 x 108 CFU / ml). For IL1, TNF, IL-6, iNOS and TLR-4 cytokine gene expression assays, macrophages were only treated with LPPII (1 g/ mL or 10 g/ mL) or LP+IAA (10 g / mL), or bacterial LPS stimulation, followed by curative or preventative treatments with LPPII (1 g/ mL or 10 g/ mL) or LP+IAA (10 g/ mL). The results show that macrophages infected with a S. Typhimurium C5 and treated with LPPII in a preventative or curative manner, reduced the number of viable bacteria in the intracellular environment. In this case, macrophages treated preventively with LPPII 10 g/ mL, showed a significant decrease (p <0.05) in the amount of intracellular bacteria when compared to the control, macrophages without LPPII treatment. In the curative form, significant decrease of intracellular S. Typhimurium was observed in LPPII1g/ mL-treated macrophages compared to control cells, without LPPII treatment. On the other hand, the groups treated with LPPII+IAA had a greater number of intracellular bacteria, suggesting the action of cysteine proteases on the observed antimicrobial effect. Curative treatment with LPPII also increased the viability of infected macrophages relative to the untreated control groups. Thus, groups treated with LPPII1g/ mL obtained viability 14.74% greater than the control group without treatment, whereas macrophages treated with LPPII10g/ mL obtained 24.11%. Groups of macrophages stimulated with LPS and then treated with LPPII had a reduction in the gene expression of the inflammatory cytokines TNF, IL1- and IL-6, in addition to Toll-like receptor 4. Taken together, we found that LPPII obtained from latex of C. procera presents biomolecules with immunomodulatory activity beneficial to the control of S. Typhimurium infections.