Resumo
Espécies de fungos são isoladas com frequência da microbiota de diversos sítios anatômicos de animais sem causar danos ao hospedeiro, podendo ser encontradas também em ambientes terrestres e aquáticos, especialmente em áreas de cultivo animal. Espécies de Candida são comumente isoladas destes ambientes e de animais, sendo frequente a resistência a azólicos nestes isolados, por vezes, maior que o observado em isolados humanos. Este aparente paradoxo é mal compreendido, uma vez que a exposição de cepas ambientais e animais a estes antifúngicos não ocorre por tratamento/profilaxia dos hospedeiros animais. O presente estudo verificou a atividade antifúngica de extratos de Moringa oleifera frente 14 cepas de Candida spp. (3 C. ciferrii; 6 C. famata; 2 C. guilliermondii; 2 C. parapsilosis; e 1 C. tropicalis) e 10 cepas de Hortaea werneckii isolados da carcinicultura de M. amazonicum, assim como avaliou a toxicidade destes extratos in vitro. Ademais, foi investigada a expressão gênica das bombas de efluxo CDR1 e CDR2 em cepas de C. albicans resistentes a azólicos isoladas de animais (n=16) e humanos (n=2) e também a influência da exposição ao tetraconazol (azólico agrícola) e malathion (organofosforado) na ocorrência de resistência ao fluconazol, itraconazol e voriconazol em C. parapsilosis ATCC 22019. A partir dos dados obtidos no teste de microdiluição in vitro, evidenciou-se que o extrato clorofórmico de flores inibiu o crescimento de todas as cepas fúngicas associadas à carcinicultura de M. amazonicum. O extrato etanólico de folhas, flores e sementes inibiu o crescimento de 22/24, 21/24 e 20/24 cepas, respectivamente. O extrato de vagens inibiu somente cepas de Candida spp. (14/14) e, por sua vez, o extrato de caule inibiu apenas quatro cepas de H. werneckii (4/10). Os extratos de sementes, flores (fração clorofórmica), caules e folhas apresentaram baixa ou nenhuma toxicidade em larvas de M. amazonicum, enquanto que extratos de vagens e flores (fração etanólica) apresentaram toxicidade moderada. Quanto à expressão gênica analisada por qPCR, verificou-se que há correlação entre a resistência a fluconazol e a expressão de CDR1 em C. albicans resistentes a azólicos, uma vez que a expressão de CDR1 estava aumentada em 56,25% (9/16) destas cepas. Foi demonstrado ainda que a exposição, in vitro, ao tetraconazol, mas não ao malathion, diminui a sensibilidade aos azólicos clínicos, especialmente ao fluconazol. Este fenômeno é mediado, pelo menos em parte, pela atividade de bombas de efluxo dependentes de ATP, haja visto o aumento da sensibilidade das réplicas de C. parapsilosis, com o uso de prometazina; assim como o aumento no efluxo de rhodamina 6G e o aumento de expressão dos genes das bombas de efluxo CDR. Também há indícios de envolvimento de bombas MDR nas réplicas resistentes a fluconazol, sem alteração na biossíntese de ergosterol nem na expressão do gene ERG11. Portanto, ficou demonstrado na primeira parte deste trabalho, a potencialidade do uso de extratos de M. oleifera no controle de fungos associados a carcinicultura de M. amazonicum. Ademais, ficou evidente, na análise molecular, o envolvimento de bombas de efluxo CDR em C. albicans de origem animal resistentes a azólicos. Por fim, demonstrou-se que a exposição de C. parapsilosis ao tetraconazol, in vitro, induz resistência a azólicos de uso clínico também via superexpressão de CDR.
Fungal species are often isolated from microbiota of several anatomical sites from animals without causing harm to the host, and can also be found in terrestrial and aquatic environments, especially in animal farming areas. Candida species are opportunistic pathogens commonly isolated from these environments and animals, and azole resistance are frequent in these isolates, sometimes greater than that observed in human isolates. This apparent paradox is poorly understood, since exposure of environmental and animal strains to these antifungals does not occur during treatment/prophylaxis of animal hosts. This study investigated the antifungal activity of M. oleifera extracts against 14 strains of Candida spp. (3 C. ciferrii; 6 C. famata; 2 C. guilliermondii; 2 C. parapsilosis; and 1 C. tropicalis) and 10 strains of Hortaea werneckii isolated from shrimp Macrobrachium amazonicum, as well as the in vitro toxicity of these extracts. In addition, we investigated the gene expression of efflux pumps CDR1 and CDR2 in azole-resistant C. albicans strains from animals (n = 16) and humans (n = 2) and also the influence of exposure to tetraconazole (agricultural azole) and malathion (organophosphate) in the occurrence of resistance to fluconazole, itraconazole and voriconazole in C. parapsilosis ATCC 22019. Data from in vitro microdilution test demonstrated that the chloroform flower extract inhibits the growth of all tested fungal strains from shrimp M. amazonicum. The ethanolic extract of leaves, flowers and seeds inhibited the growth of 22/24, 21/24 and 20/24 of strains, respectively. The ethanolic extract of pods inhibited Candida spp. strains (14/14), in its turn, extracts of stem inhibited only four strains of H. werneckii (4/10). The extract of seed, flowers (chloroform fraction), stems and leaves showed low or no toxicity, while ethanolic pods and flowers extracts showed moderate toxicity. Concerning efflux pumps gene expression by qPCR, it was observed correlation between resistance to fluconazole and CDR1 expression in azole resistant C. albicans, since the CDR1 expression was increased in 56.25% (9/16) in these strains. Additionally, it was shown that exposure to tetraconazole, but not to malathion, decreases susceptibility to clinical azoles, particularly to fluconazole. This phenomenon is mediated, at least partially, by the increased activity of ATP-dependent efflux pumps, considering the increase in antifungal susceptibility after the addition of the efflux pump inhibitor promethazine, the increase in efflux of rhodamine 6G and in CDR gene expression. There is also evidence of involvement of MDR pumps in fluconazole-resistant replicas, with no change in ergosterol biosynthesis or in the expression of ERG11 gene. Therefore, the first part of this study showed the potential use of M. oleifera extracts in M. amazonicum shrimp farming fungal control. Moreover, in the molecular analysis, it was evident the involvement of CDR efflux pumps in azole resistance in C. albicans strains from animals. Finally, it was shown that in vitro exposure to tetraconazole in C. parapsilosis induces clinical azole resistance by CDR overexpression too.