Resumo
A clonagem por transferência nuclear de células somáticas consiste numa atraente ferramenta para a conservação da biodiversidade e sua eficiência depende da obtenção e seleção de células doadoras de núcleo derivadas da pele de indivíduos de interesse. Especificamente para catetos, mamíferos silvestres encontrados algumas vezes em regiões de difícil acesso ou distantes de laboratórios especializados, o armazenamento a 46°C de tecidos da pele seria uma alternativa para a conservação do material genético desses animais. Portanto, o objetivo foi avaliar diferentes períodos de armazenamento e a presença de meio nutritivo sobre a recuperação de células somáticas derivadas da pele de catetos. Para tanto, 476 explantes auriculares (9,0 mm3) recuperados de onze animais adultos, oriundos do Centro de Multiplicação de Animais Silvestres (CEMAS/UFERSA), foram distribuídos em sete grupos: amostras não refrigeradas (controle) e refrigeradas na ausência ou presença de Meio de Eagle Modificado por Dulbecco suplementado com 2,2 g/L de bicarbonato de sódio, 10% de soro fetal bovino e 2% de solução de antibiótico-antimicótico por 10, 30 e 50 dias de estocagem. Para as análises histológicas, amostras foram fixadas em paraformaldeído a 4%, processadas e coradas com hematoxilina-eosina para avaliação da espessura da epiderme e derme, número de fibroblastos e halos. Além disso, fragmentos foram avaliados quanto à quantificação de regiões argirofílicas organizadoras nucleolares (AgNORs) e atividade metabólica por brometo de 3-[4,5-dimetil-tiazol-2-il]-2,5-difeniltetrazólio (MTT). Para as análises de cultivo in vitro, explantes foram cultivados e avaliados quanto à morfologia celular, qualidade do cultivo, viabilidade celular por azul de tripan, atividade proliferativa pela determinação da curva de crescimento e tempo de duplicação da população celular e atividade metabólica pelo ensaio de MTT. Comparações entre os fragmentos refrigerados e não refrigerados foram analisadas usando o software GraphPad Prisma. Quanto à espessura tecidual, apenas os fragmentos armazenados por 50 dias na ausência de meio nutritivo, apresentaram uma redução e aumento, respectivamente, da espessura da epiderme (55,8 ± 3,2 m vs. 64,8 ± 2,1 m) e derme (172,7 ± 2,5 m vs. 147,6 ± 2,5 m) quando comparado ao controle (P < 0,05). Além disso, o período de estocagem, independente da presença de meio, promoveu uma redução do número de fibroblastos e aumento no número de halos. Ainda, o número de AgNORs indicando atividade proliferativa, e atividade metabólica dos explantes, diminuíram com o período de armazenamento. Após o cultivo in vitro dos explantes, apenas os fragmentos armazenados sem meio por 50 dias não foram capazes de obter células somáticas. Além disso, células oriundas de explantes na presença de meio por 10 dias mostraram características similares às células de explantes não refrigerados, especialmente quanto à duração do cultivo, tempo de duplicação da população celular, dia de todos os explantes aderidos e tempo total de subconfluência. Desta forma, células viáveis de catetos podem ser recuperadas de fragmentos teciduais armazenados por até 50 dias na presença de meio nutritivo; contudo, tecidos somáticos refrigerados até 10 dias na presença de meio resultaram em células mais viáveis.
Cloning by somatic cell nuclear transfer is an attractive tool for biodiversity conservation and its efficiency depends on the obtaining and selection of nucleus donor cells derived from the skin of individuals of interest. Specifically for collared peccaries, wild mammals found sometimes in regions difficult to access or far from specialized laboratories, the storage at 46°C of skin tissues would be an alternative for the conservation of the genetic material of these animals. Therefore, the aim was to evaluate different periods of storage and the presence of nutrient medium on the recovery of somatic cells derived from skin of collared peccaries. Thus, 476 ear explants (9.0 mm3) recovered from eleven adult animals from the Centro de Multiplicação de Animais Silvestres (CEMAS/UFERSA) were distributed in seven groups: samples not refrigerated (control) and refrigerated in absence or presence of Dulbeccos Modified Eagles Medium supplemented with 2.2 g/L sodium bicarbonate, 10% fetal bovine serum and 2% antibioticantimycotic for 10, 30 and 50 days of storage. For the histological analyzes, samples were fixed in 4% paraformaldehyde, processed and stained with hematoxylin-eosin for evaluation of epidermal and dermal thickness, number of fibroblasts and halos. Moreover, fragments were evaluated for the quantification of argyrophilic nucleolar organizer region (AgNORs) and metabolic activity by 3-[4,5-dimethylthiazol- 2-yl] -2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT). For in vitro culture analyzes, explants were cultured and evaluated for cell morphology, culture quality, cell viability by trypan blue, proliferative activity by determination of the growth curve and doubling time of the cell population and metabolic activity by MTT assay. Comparisons between the refrigerated and not refrigerated fragments were analyzed using the GraphPad Prisma software. As for the tissue thickness, only the fragments stored for 50 days in the absence of nutrient medium showed a reduction and increase, respectively, in the thickness of the epidermis (55.8 ± 3.2 m vs. 64.8 ± 2.1 m) and dermis (172.7 ± 2.5 m vs. 147.6 ± 2.5 m) when compared to control (P < 0.05). Moreover, the storage period, regardless of the presence of medium, promoted a reduction in the number of fibroblasts and increase in the number of halos. Also, the number of AgNORs indicating proliferative activity, and metabolic activity of the explants, decreased with the storage period. After the in vitro culture of the explants, only the fragments stored without medium for 50 days were not able to obtain somatic cells. Likewise, cells from explants in the presence of medium for 10 days showed similar characteristics to the cells of not refrigerated explants, especially regarding the duration of culture, doubling time of the cell population, day of all attached explants and subconfluence total time. Thus, viable cells derived from collared peccaries can be recovered from tissue fragments stored for up to 50 days in the presence of nutrient medium; nevertheless, refrigerated somatic tissues up to 10 days in the presence of medium resulted in more viable cells.