Survival rates of mouse blastocyst vitrified in dimethylformamide based solutions associated with ethylene glicol or 1-2 propanediol

The aim of this study was to determine the effect of dimethylformamide (DF) associated with ethylene glycol (EG) or 1-2 propanediol (PROH) during vitrification, on the in vitro development of mouse blastocysts. Cryoprotectant toxicity was evaluated exposing embryos into three different equilibrium solutions (ES) composed by DF, EG or PROH mixtures (10% v/v of each) in mPBS + 0.5% PVA at different interval times (1, 3 and 10min). In a second experiment, embryos were exposed to the same ES (either 1 or 3min), following for the three respectively vitrification solutions (VS) (20% v/v of each) for 30s. After 72 hours of in vitro culture, embryo hatching and expansion rates were similar for the ES1 and ES2 equilibration solutions during the time interval of 1 or 3min. However embryos exposed for 10 min to the DF equilibration solutions, had lower survival rates than EG-PROH solution (P 0.01). Furthermore, survival rates for embryos exposed to DF-PROH (ES+VS) were lower than embryos exposed to the other solutions (P 0.01). Blastocyst vitrification was performed with the three ES+VS (for 1min and 30s, respectively), using glass micropipettes (GMP). Survival rates were lower for blastocysts vitrified with DF solutions (3%-3/108 and 17.1%-19/111) (P 0.01) than with PROH+EG vitrification solutions (69%-73/105). In conclusion, DF as a cryoprotectant into vitrification solutions have deleterious effects on the in vitro developmental competence of vitrified mouse blastocysts.

O objetivo deste estudo foi determinar o efeito da dimetilformamida (DF) associada com etileno glycol (EG) ou 1-2 propanediol (PROH) durante a vitrificação, no desenvolvimento in vitro de blastocistos murinos. A toxicidade dos crioprotetores foi avaliada ao expor os embriões as três soluções de equilíbrio (ES) compostas pelas misturas de DF, EG ou PROH (10% v/v de cada) em mPBS + 0,5% PVA, em diferentes intervalos de tempo (1, 3 e 10min). Em um segundo experimento, os embriões foram expostos as mesmas ES (durante 1 e 3min), seguido da exposição as três respectivas soluções de vitrificação (VS) (20% v/v de cada) durante 30seg. Após 72 horas de cultivo in vitro, as taxas de expansão e eclosão dos embriões expostos durante os períodos de 1 e 3min às soluções de equilíbrio ES1 e ES2 foram semelhantes. No entanto, os embriões expostos durante 10min às soluções de equilíbrio com DF apresentaram taxas de sobrevivência inferiores à solução de EG-PROH (P 0,01). Além disso, as taxas de sobrevivência dos embriões expostos à DF-PROH (ES+VS) foram menores que as dos embriões expostos as outras soluções (P 0,01). A vitrificação dos blastocistos foi realizada após a exposição dos embriões nas três ES+VS (por 1min e 30seg, respectivamente), usando micropipetas de vidro (GMP). As taxas de sobrevivência foram menores nos blastocistos vitrificados nas soluções compostas por DF (3%-3/108 e 17,1%-19/111), em relação à solução EG-PROH (69%-73/105) (P 0,01). Em conclusão, a DF adicionada como crioprotetor às soluções de vitrificação apresenta efeitos deletérios na capacidade de desenvolvimento in vitro dos blastocistos murinos vitrificados.

Survival rates of mouse blastocyst vitrified in dimethylformamide based solutions associated with ethylene glicol or 1-2 propanediol

The aim of this study was to determine the effect of dimethylformamide (DF) associated with ethylene glycol (EG) or 1-2 propanediol (PROH) during vitrification, on the in vitro development of mouse blastocysts. Cryoprotectant toxicity was evaluated exposing embryos into three different equilibrium solutions (ES) composed by DF, EG or PROH mixtures (10% v/v of each) in mPBS + 0.5% PVA at different interval times (1, 3 and 10min). In a second experiment, embryos were exposed to the same ES (either 1 or 3min), following for the three respectively vitrification solutions (VS) (20% v/v of each) for 30s. After 72 hours of in vitro culture, embryo hatching and expansion rates were similar for the ES1 and ES2 equilibration solutions during the time interval of 1 or 3min. However embryos exposed for 10 min to the DF equilibration solutions, had lower survival rates than EG-PROH solution (P 0.01). Furthermore, survival rates for embryos exposed to DF-PROH (ES+VS) were lower than embryos exposed to the other solutions (P 0.01). Blastocyst vitrification was performed with the three ES+VS (for 1min and 30s, respectively), using glass micropipettes (GMP). Survival rates were lower for blastocysts vitrified with DF solutions (3%-3/108 and 17.1%-19/111) (P 0.01) than with PROH+EG vitrification solutions (69%-73/105). In conclusion, DF as a cryoprotectant into vitrification solutions have deleterious effects on the in vitro developmental competence of vitrified mouse blastocysts.

O objetivo deste estudo foi determinar o efeito da dimetilformamida (DF) associada com etileno glycol (EG) ou 1-2 propanediol (PROH) durante a vitrificação, no desenvolvimento in vitro de blastocistos murinos. A toxicidade dos crioprotetores foi avaliada ao expor os embriões as três soluções de equilíbrio (ES) compostas pelas misturas de DF, EG ou PROH (10% v/v de cada) em mPBS + 0,5% PVA, em diferentes intervalos de tempo (1, 3 e 10min). Em um segundo experimento, os embriões foram expostos as mesmas ES (durante 1 e 3min), seguido da exposição as três respectivas soluções de vitrificação (VS) (20% v/v de cada) durante 30seg. Após 72 horas de cultivo in vitro, as taxas de expansão e eclosão dos embriões expostos durante os períodos de 1 e 3min às soluções de equilíbrio ES1 e ES2 foram semelhantes. No entanto, os embriões expostos durante 10min às soluções de equilíbrio com DF apresentaram taxas de sobrevivência inferiores à solução de EG-PROH (P 0,01). Além disso, as taxas de sobrevivência dos embriões expostos à DF-PROH (ES+VS) foram menores que as dos embriões expostos as outras soluções (P 0,01). A vitrificação dos blastocistos foi realizada após a exposição dos embriões nas três ES+VS (por 1min e 30seg, respectivamente), usando micropipetas de vidro (GMP). As taxas de sobrevivência foram menores nos blastocistos vitrificados nas soluções compostas por DF (3%-3/108 e 17,1%-19/111), em relação à solução EG-PROH (69%-73/105) (P 0,01). Em conclusão, a DF adicionada como crioprotetor às soluções de vitrificação apresenta efeitos deletérios na capacidade de desenvolvimento in vitro dos blastocistos murinos vitrificados.

Survival rates of mouse blastocyst vitrified in dimethylformamide based solutions associated with ethylene glicol or 1-2 propanediol

The aim of this study was to determine the effect of dimethylformamide (DF) associated with ethylene glycol (EG) or 1-2 propanediol (PROH) during vitrification, on the in vitro development of mouse blastocysts. Cryoprotectant toxicity was evaluated exposing embryos into three different equilibrium solutions (ES) composed by DF, EG or PROH mixtures (10% v/v of each) in mPBS + 0.5% PVA at different interval times (1, 3 and 10min). In a second experiment, embryos were exposed to the same ES (either 1 or 3min), following for the three respectively vitrification solutions (VS) (20% v/v of each) for 30s. After 72 hours of in vitro culture, embryo hatching and expansion rates were similar for the ES1 and ES2 equilibration solutions during the time interval of 1 or 3min. However embryos exposed for 10 min to the DF equilibration solutions, had lower survival rates than EG-PROH solution (P 0.01). Furthermore, survival rates for embryos exposed to DF-PROH (ES+VS) were lower than embryos exposed to the other solutions (P 0.01). Blastocyst vitrification was performed with the three ES+VS (for 1min and 30s, respectively), using glass micropipettes (GMP). Survival rates were lower for blastocysts vitrified with DF solutions (3%-3/108 and 17.1%-19/111) (P 0.01) than with PROH+EG vitrification solutions (69%-73/105). In conclusion, DF as a cryoprotectant into vitrification solutions have deleterious effects on the in vitro developmental competence of vitrified mouse blastocysts.

O objetivo deste estudo foi determinar o efeito da dimetilformamida (DF) associada com etileno glycol (EG) ou 1-2 propanediol (PROH) durante a vitrificação, no desenvolvimento in vitro de blastocistos murinos. A toxicidade dos crioprotetores foi avaliada ao expor os embriões as três soluções de equilíbrio (ES) compostas pelas misturas de DF, EG ou PROH (10% v/v de cada) em mPBS + 0,5% PVA, em diferentes intervalos de tempo (1, 3 e 10min). Em um segundo experimento, os embriões foram expostos as mesmas ES (durante 1 e 3min), seguido da exposição as três respectivas soluções de vitrificação (VS) (20% v/v de cada) durante 30seg. Após 72 horas de cultivo in vitro, as taxas de expansão e eclosão dos embriões expostos durante os períodos de 1 e 3min às soluções de equilíbrio ES1 e ES2 foram semelhantes. No entanto, os embriões expostos durante 10min às soluções de equilíbrio com DF apresentaram taxas de sobrevivência inferiores à solução de EG-PROH (P 0,01). Além disso, as taxas de sobrevivência dos embriões expostos à DF-PROH (ES+VS) foram menores que as dos embriões expostos as outras soluções (P 0,01). A vitrificação dos blastocistos foi realizada após a exposição dos embriões nas três ES+VS (por 1min e 30seg, respectivamente), usando micropipetas de vidro (GMP). As taxas de sobrevivência foram menores nos blastocistos vitrificados nas soluções compostas por DF (3%-3/108 e 17,1%-19/111), em relação à solução EG-PROH (69%-73/105) (P 0,01). Em conclusão, a DF adicionada como crioprotetor às soluções de vitrificação apresenta efeitos deletérios na capacidade de desenvolvimento in vitro dos blastocistos murinos vitrificados.

Uso de oócitos bovinos como citoplasma receptor na produção de embriões por transferência nuclear de célula somática interespécie (NTSCi)

Interspecies embryo clones have been produced by research groups with relative success in some species. Bovine oocytes matured in vitro and enucleated by micromanipulation were used in three experiments as recipeient cytoplasm in nuclear transfer of ovine, caprine and porcine fibroblasts. The fibroblasts were cultivated until the third passage before being frozen and used. The electrofusion was induced by an application of a 20V pulse during 45 ms. The activation was done with 5 mM ionomycin and subsequently 2 mM 6DMAP. NTSC bovine embryos, NTSCi caprine and ovine embryos were cultivated in SOF medium and NTSCi porcine embryos were cultivated in NCSU23 medium. The fusion rates of the reconstructed complexes with bovine cells did not differ from those observed with ovine cells (88.2%), caprine cells (74.1%) and porcine cells (79.4%). The cleavage rates in ovine (60.3%), caprine (68.4%) and porcine (57.1%) NTSCi groups did not differ from the control group NTSC bovine. The blastocyst rate observed in the group of NTSCi ovine embryos (10.3%) was similar to the group of NTSC bovine embryos (12.7%). In NTSCi caprine embryos, 5.3% of the embryos developed up to the blastocyst stage, while in the NTSCi porcine group there was no development up to the blastocyst stage. In conclusion, the bovine cytoplasm was able to support the embryo development in NTSCi up to the blastocyst stage usi

Otimização do sistema de produção de clones por transferência nuclear de célula somática (NTSC)

A técnica de transferência nuclear é uma ferramenta que possibilita a produção de embriões clones que podem ser utilizados tanto na clonagem reprodutiva como no modelo para o estudo de diversos mecanismos fisiológicos durante o desenvolvimento embrionário. Neste sentido, embriões clones bovinos foram produzidos por transferência nuclear, com o objetivo de estabelecer a técnica de clonagem, bem como otimizála para as condições do Laboratório de Embriologia e Biotécnicas de Reprodução da UFRGS. Durante este estudo, 1.123 estruturas foram reconstruídas em diferentes condições, sendo que 95 blastocistos foram produzidos em 56 replicações. O primeiro blastocisto foi produzido na 5ª rotina. Após a transferência de parte destes embriões, 13 prenhezes foram estabelecidas, entretanto, a maioria delas foi interrompida no terço inicial da gestação. Uma prenhez gemelar alcançou 260 dias, momento em que os fetos foram abortados. Outra gestação foi a termo, com o nascimento de um clone vivo, porém, o animal veio a óbito 42 horas após o nascimento.

Bovine in vitro embryo production protocol: does it really influence embryo cryotolerance?

The protocol of  in vitro production (IVP) of bovine embryos is one of the critical factors determining embryo viability after cryopreservation. In this study were used two differents protocols to produce IVP bovine embryos, with variations in protein source, oocyte/zygote density per media volume, with the aim to determine the in vitro and in vivo embryo survival after vitrification using hand-pulled glass micropipettes. Expanded blastocysts (D7) were morphologically selected by size (?180 ?m) and osmotic behavior before they were randomly allocated to sub-groups by protocol: non-vitrified embryos (control; C) and vitrified embryos (V). For the evaluation of the in vitro survival, control embryos and a group of warmed vitrified embryos were in vitro-cultured (IVC) for 72 h. Re-expansion rates of warmed embryos at 24 h of IVC were 94.8% and 93.2% for Protocols 1 and 2, respectively. Hatching rates at 72 h of IVC of embryos from Protocol 1 (C=80% and V=75.8%) tended to be higher (P=0.0561, Chi2 test) than those from Protocol 2 (C=67.2% and V=59.3%). For the evaluation of in vivo survival, 21 vitrified embryos per protocol were singly non-surgically transferred to synchronized recipients (n=42) after the in-straw cryoprotectant dilution, resulting in 4 (19%) pregnancies per group on Day 60 of gestation. In conclusion, despite a lower variation on in vitro embryo development betwe

In vitro and in vivo survival of mouse morulas and blastocysts following vitrification in 45% glycerol

The toxicity of cryoprotectant agents is one of the critical factors for the successful vitrification of mammalian embryos, which depends on the concentration, time and temperature of exposure to the cryoprotectant. Moreover, embryos from different species or stages of development have distinct levels of tolerance to cryoprotectant agents. This study aimed to evaluate the in vitro and in vivo survivals of mouse embryos after distinct times of exposure to two cryoprotectant concentrations prior to vitrification. In Experiment 1, compact morulas, blastocysts and expanded blastocysts were exposed to 10% glycerol for 10 min (group 1) or to 25% glycerol for 10, 5 and 2.5 min (groups 2, 3, and 4, respectively) prior to their exposure to the vitrification solution containing 45% glycerol for 1 min at 20C before immersion in liquid nitrogen. Embryos were thawed in a water bath at 20C for 20 sec, and the cryoprotectant was diluted in 1 M sucrose for 10 min. Then, embryos were morphologically evaluated following in vitro culture for 1 and 48 h. In vitro survivals of compact morulas and blastocysts were not affected by glycerol concentration and/or equilibration time prior to vitrification. However, expanded blastocysts demonstrated a lower survivability to vitrification. In Experiment 2, fresh and vitrified (according to procedures in group 1, Experiment 1) compact morulas and blastocy

Vitrificação de embriões Mus domesticus domesticus contidos em volumes diferentes de 9,0 M de etileno glicol

Os experimentos tiveram como objetivo determinar a taxa de eclosão dos embriões vitrificados em volumes diferentes de 9,0M de etileno glicol. Simultaneamente, testaram-se dois procedimentos de estocagem dos fios de teflon, denominados caixade aço inoxidável e globete/raque. No experimento I, os 881 embriões coletados foram distribuídos em 4 tratamentos: tratamento1 (T1 = controle): 307 embriões foram cultivados in vitro em meio PBSm, acrescido de 0,4% de BSA; tratamento 2 (T2): 292embriões foram expostos à solução de glicerol 10% acrescida de 0,4% de BSA, envasados em palhetas de 0,25 mL esubmetidos ao congelamento pelo método rápido em Biocool®; tratamento 3 (T3): 138 embriões foram expostos durante 2minutos à solução de desidratação (10% de EG + 6% BSA em PBSm) e então transferidos para a solução de vitrificação (50%de EG + 6% de BSA em PBSm), onde permaneceram por 30 segundos sendo após transferidos para o volume de 1 L nointerior de um fio de teflon, medindo 0,4mm de diâmetro, 2,0cm de comprimento e 0,05mm de espessura. Os fios foramacondicionados em uma caixa de aço inoxidável para serem armazenados em nitrogênio líquido; tratamento 4 (T4): 144 embriõesforam expostos à solução de desidratação (10% de EG + 6% BSA em PBSm) e após 2 minutos, foram transferidos para asolução de vitrificação (50% de EG + 6% BSA em PBSm), onde permaneceram por 30 segundos e foram colocados em v

Sobrevivência de blastocistos Mus domesticus domesticus vitrificados em meio contendo 9,0m de etileno glicol na presença de sacarose

The aim of these experiments was to determine the in vitro and in vivo survivability of Mus domesticus domesticus blastocysts, following exposure and vitrification in modified PBS solution containing 9.0M of ethylene glycol (EG) and 0.3M of sucrose. The cryoprotectant solutions were denominated I (without sucrose) and IS (with sucrose) when the embryo exposure to the solutions has been done in two steps. First the embryos were exposed to a modified PBS solution with 1,8M EG + 6% BSA during 2 minutes, and after they were transferred to straws containing modified PBS plus 9.0M EG + 6% BSA and after 30 seconds immersed into liquid nitrogen. The others cryoprotectant solutions, denominated II (without sucrose) and IIS (with sucrose) the embryos were exposed directly to the 9.0M EG and after 30 seconds plunged into the liquid nitrogen. In the first experiment a survival rate of 299 blastocysts was observed following exposure to cryoprotectant solutions. There was no statistical diference among control and treatment groups. The experiment II allowed to evaluate the in vitro embryo survival, after vitrification of 330 blastocysts, the cryoprotectant solutions I and IS determinated statistically different (p 0.05) embryo survival rates, showing in vitro hatching rates of 49 and 40%, respectively. In experiment 3, 141 blastocysts were exposed to the cryoprotectant solutions I and IS, vitrified and then transferred into the recipients. The number of implantations and fetuses were observed after 14 days of gestation. There was no statistical difference (p>0.05) among the solutions I and IS in the number of implantations (37 and 32%) and fetuses (27 and 27%), respectively. The survival rate of Mus domesticus domesticus blastocysts did not improve with the addition of sucrose to the vitrification solution containing 9.0M of EG.

Os experimentos realizados tiveram como objetivo determinar a taxa de sobrevivência in vitro e in vivo de blastocistos Mus domesticus domesticus vitrificados em meio contendo 9,0M de etileno glicol e 0,3M de sacarose. As soluções testadas foram denominadas de I e IS, quando a adição do crioprotetor foi realizada em duas etapas, e II e IIS, quando a adição deste foi realizada em apenas uma etapa. Na solução de vitrificação I, foi realizada inicialmente uma desidratação prévia dos embriões por um período de 2 minutos em solução de 1,8M de EG em PBS + 6% de BSA e, logo após, eles foram transferidos, por um período de 30 segundos, para a solução composta por uma associação de 9,0M de EG em PBS + 6% de BSA, antes da imersão em nitrogênio líquido. Na solução de vitrificação IS, o procedimento foi idêntico ao da solução I, apenas com o acréscimo de 0,3M de sacarose às soluções crioprotetoras. Na solução de vitrificação II, os embriões foram expostos diretamente a uma solução composta por uma associação de 9,0M de EG em PBS + 6% de BSA, onde permaneciam por 30 segundos antes da imersão em nitrogênio líquido. Na solução de vitrificação IIS, o procedimento foi idêntico ao da solução II, apenas com a adição de 0,3M de sacarose à solução crioprotetora. No experimento I, foi determinada a taxa de sobrevivência de 299 blastocistos após a exposição às soluções crioprotetoras, não sendo observada diferença estatística entre os tratamentos e o grupo controle. O experimento II permitiu avaliar a sobrevivência embrionária in vitro (taxa de eclosão) após a vitrificação de 330 blastocistos, onde as soluções I e IS foram estatisticamente superiores às demais, apresentando taxas de eclosão de 49 e 40%, respectivamente. No experimento III, realizou-se a transferência de 141 blastocistos vitrificados, após a exposição às soluções I e IS, para fêmeas receptoras. Não houve diferenças estatísticas entre as taxas de sobrevivência embrionária determinadas aos 14 dias de prenhez, tanto para implantações (37 e 32%) quanto para fetos (27 e 27%), respectivamente. A presença de sacarose na solução de vitrificação não proporcionou uma maior sobrevivência de blastocistos Mus domesticus domesticus vitrificados em uma solução contendo 9,0M EG.

In vitro and in vivo survival of mouse morulas and blastocysts following vitrification in 45% glycerol

The toxicity of cryoprotectant agents is one of the critical factors for the successful vitrification of mammalian embryos, which depends on the concentration, time and temperature of exposure to the cryoprotectant. Moreover, embryos from different species or stages of development have distinct levels of tolerance to cryoprotectant agents. This study aimed to evaluate the in vitro and in vivo survivals of mouse embryos after distinct times of exposure to two cryoprotectant concentrations prior to vitrification. In Experiment 1, compact morulas, blastocysts and expanded blastocysts were exposed to 10% glycerol for 10 min (group 1) or to 25% glycerol for 10, 5 and 2.5 min (groups 2, 3, and 4, respectively) prior to their exposure to the vitrification solution containing 45% glycerol for 1 min at 20C before immersion in liquid nitrogen. Embryos were thawed in a water bath at 20C for 20 sec, and the cryoprotectant was diluted in 1 M sucrose for 10 min. Then, embryos were morphologically evaluated following in vitro culture for 1 and 48 h. In vitro survivals of compact morulas and blastocysts were not affected by glycerol concentration and/or equilibration time prior to vitrification. However, expanded blastocysts demonstrated a lower survivability to vitrification. In Experiment 2, fresh and vitrified (according to procedures in group 1, Experiment 1) compact morulas and blastocy

Sobrevivência de blastocistos Mus domesticus domesticus vitrificados em meio contendo 9,0m de etileno glicol na presença de sacarose

The aim of these experiments was to determine the in vitro and in vivo survivability of Mus domesticus domesticus blastocysts, following exposure and vitrification in modified PBS solution containing 9.0M of ethylene glycol (EG) and 0.3M of sucrose. The cryoprotectant solutions were denominated I (without sucrose) and IS (with sucrose) when the embryo exposure to the solutions has been done in two steps. First the embryos were exposed to a modified PBS solution with 1,8M EG + 6% BSA during 2 minutes, and after they were transferred to straws containing modified PBS plus 9.0M EG + 6% BSA and after 30 seconds immersed into liquid nitrogen. The others cryoprotectant solutions, denominated II (without sucrose) and IIS (with sucrose) the embryos were exposed directly to the 9.0M EG and after 30 seconds plunged into the liquid nitrogen. In the first experiment a survival rate of 299 blastocysts was observed following exposure to cryoprotectant solutions. There was no statistical diference among control and treatment groups. The experiment II allowed to evaluate the in vitro embryo survival, after vitrification of 330 blastocysts, the cryoprotectant solutions I and IS determinated statistically different (p 0.05) embryo survival rates, showing in vitro hatching rates of 49 and 40%, respectively. In experiment 3, 141 blastocysts were exposed to the cryoprotectant solutions I and IS, vitrified and then transferred into the recipients. The number of implantations and fetuses were observed after 14 days of gestation. There was no statistical difference (p>0.05) among the solutions I and IS in the number of implantations (37 and 32%) and fetuses (27 and 27%), respectively. The survival rate of Mus domesticus domesticus blastocysts did not improve with the addition of sucrose to the vitrification solution containing 9.0M of EG.

Os experimentos realizados tiveram como objetivo determinar a taxa de sobrevivência in vitro e in vivo de blastocistos Mus domesticus domesticus vitrificados em meio contendo 9,0M de etileno glicol e 0,3M de sacarose. As soluções testadas foram denominadas de I e IS, quando a adição do crioprotetor foi realizada em duas etapas, e II e IIS, quando a adição deste foi realizada em apenas uma etapa. Na solução de vitrificação I, foi realizada inicialmente uma desidratação prévia dos embriões por um período de 2 minutos em solução de 1,8M de EG em PBS + 6% de BSA e, logo após, eles foram transferidos, por um período de 30 segundos, para a solução composta por uma associação de 9,0M de EG em PBS + 6% de BSA, antes da imersão em nitrogênio líquido. Na solução de vitrificação IS, o procedimento foi idêntico ao da solução I, apenas com o acréscimo de 0,3M de sacarose às soluções crioprotetoras. Na solução de vitrificação II, os embriões foram expostos diretamente a uma solução composta por uma associação de 9,0M de EG em PBS + 6% de BSA, onde permaneciam por 30 segundos antes da imersão em nitrogênio líquido. Na solução de vitrificação IIS, o procedimento foi idêntico ao da solução II, apenas com a adição de 0,3M de sacarose à solução crioprotetora. No experimento I, foi determinada a taxa de sobrevivência de 299 blastocistos após a exposição às soluções crioprotetoras, não sendo observada diferença estatística entre os tratamentos e o grupo controle. O experimento II permitiu avaliar a sobrevivência embrionária in vitro (taxa de eclosão) após a vitrificação de 330 blastocistos, onde as soluções I e IS foram estatisticamente superiores às demais, apresentando taxas de eclosão de 49 e 40%, respectivamente. No experimento III, realizou-se a transferência de 141 blastocistos vitrificados, após a exposição às soluções I e IS, para fêmeas receptoras. Não houve diferenças estatísticas entre as taxas de sobrevivência embrionária determinadas aos 14 dias de prenhez, tanto para implantações (37 e 32%) quanto para fetos (27 e 27%), respectivamente. A presença de sacarose na solução de vitrificação não proporcionou uma maior sobrevivência de blastocistos Mus domesticus domesticus vitrificados em uma solução contendo 9,0M EG.

In vitro and in vivo survival of mouse morulas and blastocysts following vitrification in 45% glycerol

The toxicity of cryoprotectant agents is one of the critical factors for the successful vitrification of mammalian embryos, which depends on the concentration, time and temperature of exposure to the cryoprotectant. Moreover, embryos from different species or stages of development have distinct levels of tolerance to cryoprotectant agents. This study aimed to evaluate the in vitro and in vivo survivals of mouse embryos after distinct times of exposure to two cryoprotectant concentrations prior to vitrification. In Experiment 1, compact morulas, blastocysts and expanded blastocysts were exposed to 10% glycerol for 10 min (group 1) or to 25% glycerol for 10, 5 and 2.5 min (groups 2, 3, and 4, respectively) prior to their exposure to the vitrification solution containing 45% glycerol for 1 min at 20C before immersion in liquid nitrogen. Embryos were thawed in a water bath at 20C for 20 sec, and the cryoprotectant was diluted in 1 M sucrose for 10 min. Then, embryos were morphologically evaluated following in vitro culture for 1 and 48 h. In vitro survivals of compact morulas and blastocysts were not affected by glycerol concentration and/or equilibration time prior to vitrification. However, expanded blastocysts demonstrated a lower survivability to vitrification. In Experiment 2, fresh and vitrified (according to procedures in group 1, Experiment 1) compact morulas and blastocy

Effects of homologous prostatic secretion on post-thaw canine spermatozoa viability / Influência da secreção prostática autóloga sobre a viabilidade de espermatozóides caninos no pós-descongelamento

Effects of homologous prostatic secretion on post-thaw motility, membrane integrity and agglutination of cryopreserved canine spermatozoa diluted in TRIS-egg-yolk and in TRIS-BSA semen extenders were investigated. The study demonstrates that the addition of prostatic secretion resulted in beneficial effect on the acrosome integrity of the spermatozoa. There werent changes regarding sperm motility rate, and exposure of spermatozoa to prostatic secretion didnt lead to a significant reduction on sperm agglutination. However, after incubation for 60 minutes at 37ºC, the addition seemed showing better sperm dissociation in TRIS-BSA 0.25% (60% of the samples). At this time, sperm survival in extenders was observed at different rates: in TRIS-egg-yolk diluent (40% of the samples), in TRIS-BSA 0.25% diluent (80% of the samples), in TRIS-BSA 0.50% diluent (40% of the samples), and in TRIS-BSA 1.00% diluent (50% of the samples).

Investigou-se o efeito da secreção prostática autóloga na motilidade pós-descongelamento, na integridade de acrossomo e na adesão intercelular de espermatozóides criopreservados em diluidores com TRIS-gema de ovo e com TRIS-BSA. O experimento mostrou que a adição de secreção prostática promoveu um efeito benéfico sobre a manutenção da integridade dos acrossomos. Não foram observadas alterações com referência à motilidade e à exposição dos espermatozóides frente à secreção prostática, também não levou a uma redução significativa da adesão interespermática. No entanto, após 60 minutos de incubação a 37ºC, a presença da fração prostática parece ter favorecido a dissociação espermática dos ejaculados diluídos com TRIS-BSA 0,25% (60% das amostras). Ao final do período de observação, foram verificadas diferentes percentagens de sobrevivência espermática nas amostras diluídas com TRIS-gema de ovo (40% das amostras), com TRIS-BSA 0,25% (80% das amostras), com TRIS-BSA 0,50% (40% das amostras) e com TRIS-BSA 1,00% (50% das amostras).

Diagnóstico ultra-sonográfico do momento ovulatório em búfalas (Bubalus bubalis) inseminadas no estro espontâneo e induzido

The aim of this experiment was to determine the interval between the beginning of the spontaneous or induced oestrus and the ovulation in females buffaloes using ultrasonography. This will be useful in the determination of the most proper moment for the pre-fixed artificial insemination. In the reproductive season, autumn in the South of Brazil (march-june), 132 clicling females were divided in 3 groups: Group A: 53 females were treated with auricular subcutaneous implant of norgestomet or intravaginal device of progesterone. In the moment that the devices were removed, 250mg of cloprostenol were applied for intravulvar submucosis (ivsm). Group B: 48 buffaloes females were treated twice with 250mg of cloprostenol for ivsm with interval of 11 days. Group C: 31 buffaloes females remained without any treatment (control group). All of them were inseminated in the moment that was observed the biggest diameter of pre-ovulatory follicle determinated by ultrasonography. In the 3 groups, there was significative difference between pregnant and non-pregnant females in the oestrus-ovulation interval and in the A.I.-ovulation interval. The pregnancy rates were 41.5%, 52.1% and 54.8% in the groups A, B amd C, respectively. The variation in the oestrus-ovulation in buffaloes is the major obstacle to achieve high pregnancy rates using pre-fixed artificial insemination in spontaneous and induced oestrus.

O objetivo deste experimento foi determinar o intervalo entre o início do estro induzido ou espontâneo e a ovulação em fêmeas bubalinas (Bubalus bubalis) com o auxílio da ultra-sonografia, o que permitirá a determinação de um horário mais apropriado para a I.A. pré-fixada. Nos meses de março a junho, outono no sul do Brasil (época reprodutiva dos bubalinos), 132 fêmeas adultas ciclando foram divididas em 3 grupos experimentais: Grupo A - 53 fêmeas foram tratadas com implante subcutâneo de Norgestomet ou espiral intravaginal contendo progesterona. Na retirada dos dispositivos, foi aplicado 250mg de cloprostenol pela via intra-submucosa vulvar (i.s.m.v.), Grupo B - 48 búfalas foram tratadas com dupla aplicação de 250mg de cloprostenol pela via i.s.m.v. com intervalo de 11 dias e Grupo C - 31 búfalas foram consideradas testemunhas, sem tratamento. Todas as búfalas foram inseminadas no momento da observação do maior diâmetro do folículo pré-ovulatório, detectado por ultra-sonografia, durante o estro. Após o diagnóstico de prenhez, constatou-se, nos três tratamentos, que houve diferença significativa entre as búfalas prenhes e vazias no período compreendido entre o início do estro até o momento da ovulação e no período entre a I.A.e a ovulação. Os índices de prenhez foram de 41,5%, 52,1% e 54,8% nos grupos A, B e C, respectivamente. A variação no intervalo estro-ovulação nas búfalas é uma barreira para a obtenção de taxas de prenhez por I.A. pré-fixada comparáveis à monta natural, tanto no estro induzido através de progesterona e prostaglandina F2 alfa como no estro espontâneo.

Bovine in vitro embryo production protocol: does it really influence embryo cryotolerance?

The protocol of  in vitro production (IVP) of bovine embryos is one of the critical factors determining embryo viability after cryopreservation. In this study were used two differents protocols to produce IVP bovine embryos, with variations in protein source, oocyte/zygote density per media volume, with the aim to determine the in vitro and in vivo embryo survival after vitrification using hand-pulled glass micropipettes. Expanded blastocysts (D7) were morphologically selected by size (?180 ?m) and osmotic behavior before they were randomly allocated to sub-groups by protocol: non-vitrified embryos (control; C) and vitrified embryos (V). For the evaluation of the in vitro survival, control embryos and a group of warmed vitrified embryos were in vitro-cultured (IVC) for 72 h. Re-expansion rates of warmed embryos at 24 h of IVC were 94.8% and 93.2% for Protocols 1 and 2, respectively. Hatching rates at 72 h of IVC of embryos from Protocol 1 (C=80% and V=75.8%) tended to be higher (P=0.0561, Chi2 test) than those from Protocol 2 (C=67.2% and V=59.3%). For the evaluation of in vivo survival, 21 vitrified embryos per protocol were singly non-surgically transferred to synchronized recipients (n=42) after the in-straw cryoprotectant dilution, resulting in 4 (19%) pregnancies per group on Day 60 of gestation. In conclusion, despite a lower variation on in vitro embryo development betwe

Diagnóstico ultra-sonográfico do momento ovulatório em búfalas (Bubalus bubalis) inseminadas no estro espontâneo e induzido

The aim of this experiment was to determine the interval between the beginning of the spontaneous or induced oestrus and the ovulation in females buffaloes using ultrasonography. This will be useful in the determination of the most proper moment for the pre-fixed artificial insemination. In the reproductive season, autumn in the South of Brazil (march-june), 132 clicling females were divided in 3 groups: Group A: 53 females were treated with auricular subcutaneous implant of norgestomet or intravaginal device of progesterone. In the moment that the devices were removed, 250mg of cloprostenol were applied for intravulvar submucosis (ivsm). Group B: 48 buffaloes females were treated twice with 250mg of cloprostenol for ivsm with interval of 11 days. Group C: 31 buffaloes females remained without any treatment (control group). All of them were inseminated in the moment that was observed the biggest diameter of pre-ovulatory follicle determinated by ultrasonography. In the 3 groups, there was significative difference between pregnant and non-pregnant females in the oestrus-ovulation interval and in the A.I.-ovulation interval. The pregnancy rates were 41.5%, 52.1% and 54.8% in the groups A, B amd C, respectively. The variation in the oestrus-ovulation in buffaloes is the major obstacle to achieve high pregnancy rates using pre-fixed artificial insemination in spontaneous and induced oestrus.

O objetivo deste experimento foi determinar o intervalo entre o início do estro induzido ou espontâneo e a ovulação em fêmeas bubalinas (Bubalus bubalis) com o auxílio da ultra-sonografia, o que permitirá a determinação de um horário mais apropriado para a I.A. pré-fixada. Nos meses de março a junho, outono no sul do Brasil (época reprodutiva dos bubalinos), 132 fêmeas adultas ciclando foram divididas em 3 grupos experimentais: Grupo A - 53 fêmeas foram tratadas com implante subcutâneo de Norgestomet ou espiral intravaginal contendo progesterona. Na retirada dos dispositivos, foi aplicado 250mg de cloprostenol pela via intra-submucosa vulvar (i.s.m.v.), Grupo B - 48 búfalas foram tratadas com dupla aplicação de 250mg de cloprostenol pela via i.s.m.v. com intervalo de 11 dias e Grupo C - 31 búfalas foram consideradas testemunhas, sem tratamento. Todas as búfalas foram inseminadas no momento da observação do maior diâmetro do folículo pré-ovulatório, detectado por ultra-sonografia, durante o estro. Após o diagnóstico de prenhez, constatou-se, nos três tratamentos, que houve diferença significativa entre as búfalas prenhes e vazias no período compreendido entre o início do estro até o momento da ovulação e no período entre a I.A.e a ovulação. Os índices de prenhez foram de 41,5%, 52,1% e 54,8% nos grupos A, B e C, respectivamente. A variação no intervalo estro-ovulação nas búfalas é uma barreira para a obtenção de taxas de prenhez por I.A. pré-fixada comparáveis à monta natural, tanto no estro induzido através de progesterona e prostaglandina F2 alfa como no estro espontâneo.

Bovine in vitro embryo production protocol: does it really influence embryo cryotolerance?

The protocol of  in vitro production (IVP) of bovine embryos is one of the critical factors determining embryo viability after cryopreservation. In this study were used two differents protocols to produce IVP bovine embryos, with variations in protein source, oocyte/zygote density per media volume, with the aim to determine the in vitro and in vivo embryo survival after vitrification using hand-pulled glass micropipettes. Expanded blastocysts (D7) were morphologically selected by size (?180 ?m) and osmotic behavior before they were randomly allocated to sub-groups by protocol: non-vitrified embryos (control; C) and vitrified embryos (V). For the evaluation of the in vitro survival, control embryos and a group of warmed vitrified embryos were in vitro-cultured (IVC) for 72 h. Re-expansion rates of warmed embryos at 24 h of IVC were 94.8% and 93.2% for Protocols 1 and 2, respectively. Hatching rates at 72 h of IVC of embryos from Protocol 1 (C=80% and V=75.8%) tended to be higher (P=0.0561, Chi2 test) than those from Protocol 2 (C=67.2% and V=59.3%). For the evaluation of in vivo survival, 21 vitrified embryos per protocol were singly non-surgically transferred to synchronized recipients (n=42) after the in-straw cryoprotectant dilution, resulting in 4 (19%) pregnancies per group on Day 60 of gestation. In conclusion, despite a lower variation on in vitro embryo development betwe

Otimização do sistema de produção de clones por transferência nuclear de célula somática (NTSC)

A técnica de transferência nuclear é uma ferramenta que possibilita a produção de embriões clones que podem ser utilizados tanto na clonagem reprodutiva como no modelo para o estudo de diversos mecanismos fisiológicos durante o desenvolvimento embrionário. Neste sentido, embriões clones bovinos foram produzidos por transferência nuclear, com o objetivo de estabelecer a técnica de clonagem, bem como otimizála para as condições do Laboratório de Embriologia e Biotécnicas de Reprodução da UFRGS. Durante este estudo, 1.123 estruturas foram reconstruídas em diferentes condições, sendo que 95 blastocistos foram produzidos em 56 replicações. O primeiro blastocisto foi produzido na 5ª rotina. Após a transferência de parte destes embriões, 13 prenhezes foram estabelecidas, entretanto, a maioria delas foi interrompida no terço inicial da gestação. Uma prenhez gemelar alcançou 260 dias, momento em que os fetos foram abortados. Outra gestação foi a termo, com o nascimento de um clone vivo, porém, o animal veio a óbito 42 horas após o nascimento.

Uso de oócitos bovinos como citoplasma receptor na produção de embriões por transferência nuclear de célula somática interespécie (NTSCi)

Interspecies embryo clones have been produced by research groups with relative success in some species. Bovine oocytes matured in vitro and enucleated by micromanipulation were used in three experiments as recipeient cytoplasm in nuclear transfer of ovine, caprine and porcine fibroblasts. The fibroblasts were cultivated until the third passage before being frozen and used. The electrofusion was induced by an application of a 20V pulse during 45 ms. The activation was done with 5 mM ionomycin and subsequently 2 mM 6DMAP. NTSC bovine embryos, NTSCi caprine and ovine embryos were cultivated in SOF medium and NTSCi porcine embryos were cultivated in NCSU23 medium. The fusion rates of the reconstructed complexes with bovine cells did not differ from those observed with ovine cells (88.2%), caprine cells (74.1%) and porcine cells (79.4%). The cleavage rates in ovine (60.3%), caprine (68.4%) and porcine (57.1%) NTSCi groups did not differ from the control group NTSC bovine. The blastocyst rate observed in the group of NTSCi ovine embryos (10.3%) was similar to the group of NTSC bovine embryos (12.7%). In NTSCi caprine embryos, 5.3% of the embryos developed up to the blastocyst stage, while in the NTSCi porcine group there was no development up to the blastocyst stage. In conclusion, the bovine cytoplasm was able to support the embryo development in NTSCi up to the blastocyst stage usi

Otimização do sistema de produção de clones por transferência nuclear de célula somática (NTSC)

A técnica de transferência nuclear é uma ferramenta que possibilita a produção de embriões clones que podem ser utilizados tanto na clonagem reprodutiva como no modelo para o estudo de diversos mecanismos fisiológicos durante o desenvolvimento embrionário. Neste sentido, embriões clones bovinos foram produzidos por transferência nuclear, com o objetivo de estabelecer a técnica de clonagem, bem como otimizála para as condições do Laboratório de Embriologia e Biotécnicas de Reprodução da UFRGS. Durante este estudo, 1.123 estruturas foram reconstruídas em diferentes condições, sendo que 95 blastocistos foram produzidos em 56 replicações. O primeiro blastocisto foi produzido na 5ª rotina. Após a transferência de parte destes embriões, 13 prenhezes foram estabelecidas, entretanto, a maioria delas foi interrompida no terço inicial da gestação. Uma prenhez gemelar alcançou 260 dias, momento em que os fetos foram abortados. Outra gestação foi a termo, com o nascimento de um clone vivo, porém, o animal veio a óbito 42 horas após o nascimento.