Remediação dos efeitos do glifosato sobre Artemia salina por isoterápico.

Um dos bioindicadores de ecotoxicidade mais utilizados em ensaios de laboratório é a Artemia salina, um microcrustáceo. O glifosato é um herbicida muito utilizado na agricultura, mas apresenta toxicidade como desregulador endócrino. Na prática homeopática é comum o tratamento de intoxicações pelo uso de isoterápicos: diluições homeopáticas de uma substância tóxica usadas para tratamento de indivíduos expostos às mesmas substâncias. Objetivo: Verificar a possível proteção de Artemia salina exposta ao glifosato pela adição de isoterápicos na água, por meio da avaliação das alterações comportamentais e morfológicas, bem como das propriedades físicas da água. Métodos: 0,6g de cistos de Artemia salina foram mantidos em garrafas de cultura, em 400mL de água do mar artificial, seguindo técnica padrão de oxigenação, luminosidade e temperatura, para promover sua eclosão em 48 horas. O glifosato foi inserido na água no momento da inserção dos cistos, na concentração letal 10% - CL 10 ou 0,002%. Os isoterápicos (Gly 6cH, 30cH, 200cH) foram preparados na véspera, em água purificada, a partir de matrizes medicamentosas previamente preparadas em farmácia credenciada na ANVISA utilizando amostras de glifosato do mesmo lote e inseridos na água de forma concomitante, na proporção de 1% do volume total de água. Ao final de 48 horas, o conteúdo líquido da garrafa contendo os estágios iniciais (I a V) de náuplios foi recolhido em um Becker, seu conteúdo foi homogeneizado e 100mL foram filtrados para obtenção da água remanescente. A água reservada foi congelada em alíquotas para posterior análise físico-química (interação com corantes solvatocrômicos). A parte não filtrada dos náuplios foi distribuída em lâminas para avaliação do desenvolvimento morfológico em microscópio óptico e uma outra parte foi distribuída em tubos transparentes na quantidade de 10 náuplios por tubo (6 tubos por grupo), para análise comportamental. Os tratamentos foram feitos em cego e os códigos foram revelados após a análise estatística. Em uma segunda etapa, a eclosão dos cistos foi observada em placa de 96 poços, com diferentes graus de salinidade e concentrações de glifosato, sendo a eclosão e a mobilidade dos náuplios registradas por câmera digital e analisadas pelo software Image J, plug-in Trackmate. Ao final, as amostras de água foram congeladas para análise físico-química utilizando corantes solvatocrômicos. Resultados: Gly 6cH aumentou a vitalidade de náuplios e a proporção entre náuplios saudáveis e defeituosos, bem como reduziu e retardou a eclosão de cistos. Os efeitos sobre a eclosão foram mais evidentes em água com 80% de salinidade e quando da exposição a baixas concentrações de glifosato (CL10). Não foram observadas diferenças entre os tratamentos em relação à locomoção dos náuplios, mas houve tendência de aumento nesse parâmetro na intoxicação com CL50. A interação das amostras de água com corantes solvatocrômicos mostrou que a cumarina foi um marcador físico-químico específico do Gly 6cH. Conclusão: Gly 6cH apresentou efeitos protetores sobre o desenvolvimento da Artemia salina exposta a baixas concentrações de glifosato (CL10), sendo o corante solvatocrômico cumarina um potencial marcador físico-químico de valor preditivo, sugerindo mecanismos relacionados a mudanças de polaridade da água.

Introduction: One of the most used bio-indicators of ecotoxicity in laboratory tests is Artemia salina, a microcrustacean known as brine shrimp. Glyphosate is an herbicide widely used in agriculture but presents toxicity as an endocrine disruptor. In homeopathic practice, it is usual to treat poisonings using isotherapies: homeopathic dilutions of a toxic substance used to treat individuals exposed to the same substances. Objective: To verify the putative protection of brine shrimps exposed to glyphosate by the addition of isotherapics in the water through the evaluation of behavioral and morphological changes and the physical properties of the water. Methods: 0.6g of Artemia salina cysts were kept in culture bottles in 400mL of artificial seawater, following normal oxygenation, luminosity, and temperature techniques, to promote their hatching in 48 hours. Glyphosate was inserted into the water simultaneously to the cysts´ insertion at a lethal concentration of 10%: CL 10 or 0.002%. The isotherapics (Gly 6cH, 30cH, 200cH) were prepared the day before, in sterile purified water, from matrices previously prepared in an accredited pharmacy, using glyphosate samples from the same batch. They were inserted into the water in a proportion of 1% of the total volume. At the end of 48 hours, the liquid content of the bottle containing the initial stages (I to V) of nauplii was collected in a Becker, its content was homogenized, and 100mL were filtered to obtain the remaining water. The reserved water was frozen into aliquots for further physicochemical analysis (interaction with solvatochromic dyes). The unfiltered part of the nauplii was distributed on slides for evaluation of morphological development under an optical microscope, and another part was distributed in transparent tubes in the amount of 10 nauplii per tube (6 tubes per group) for behavioral analysis. The treatments were performed blind, and the codes were revealed after statistical analysis. In a second stage, the hatching of the cysts was observed in a 96-well plate, with different degrees of salinity and glyphosate concentrations; hatching and nauplii activity were recorded by a digital camera analyzed by the software Image J, plug-in Trackmate. In the end, water samples were frozen for physicochemical analysis using solvatochromic dyes. Results: Gly 6cH increased the vitality of nauplii and the ratio between healthy and defective nauplii and reduced and delayed the outbreak of cysts. The effects on hatching were more evident in water with 80% salinity and when exposed to low concentrations of glyphosate (CL10). There were no differences among treatments concerning locomotion of nauplii, but there was a tendency to increase it after intoxication with LC50. The interaction of water samples with solvatochromic dyes showed that coumarin was a specific physicochemical marker for Gly 6cH. Conclusion: Gly 6cH had protective effects on the development of Artemia salina exposed to low concentrations of glyphosate (CL10), being coumarin (a solvatochromic dye) a potential physicochemical marker of predictive value, suggesting mechanisms related to changes in the polarity of water.

Análise in vitro de macrófagos infectados por Encephalitozoon cuniculi após tratamento com altas diluições de Phosphorus

Encephalitozoon cuniculi é um fungo que age como um patógeno intracelular e infecta diferentes tipos celulares. Nos coelhos e animais imunossuprimidos de outras espécies, incluindo humanos, ele parasita tecidos nervosos e causa uma síndrome neurológica muito característica, sendo esta infecção uma preocupação zoonótica. O objetivo deste trabalho foi avaliar a atividade de macrófagos infectados com E. cuniculi após o tratamento com altas diluições de Phosphorus in vitro. Para isso, culturas de macrófagos RAW 264.7 e E. cuniculi expostas a diferentes diluições de Phosphorus foram analisadas de acordo com os seguintes parâmetros: fagocitose, atividade lisossomal, produção de citocinas/quimiocinas e análise ultraestrutural. A solução controle foi o veículo usado para produzir a matriz dos medicamentos testados (30% de álcool diluído 1:100 em água, sendo 0,06% a concentração final de álcool). As avaliações foram realizadas 01 e 24 horas pós-infecção. Fagocitose e atividade lisossomal foram avaliadas usando, respectivamente, os métodos de coloração calcofluor e laranja de acridina, seguida de análise automática de imagem (Ofline Metamorph®). A produção de citocinas foi avaliada usando o sistema MAGPIX-LUMINEX. Os experimentos foram realizados em triplicata. O próprio veículo pôde aumentar a produção de IL-6, TNF alfa e MCP1 (p<0,04), reduzindo o número de parasitas fagocitados (p<0,001). Um aumento transitório de RANTES foi visto após 1 hora do tratamento com Phosphorus 200cH, seguido do aumento da atividade lisossomal na primeira e 24 horas do tratamento (p<0,002). As características ultraestruturais dos parasitas internalizados após o tratamento com Phosphorus 200cH mostraram evidências de uma atividade mais intensa de digestão do parasita em relação a células tratadas apenas com o veículo. Os resultados mostram que o tratamento dos macrófagos infectados com Phosphorus 200cH causa mudanças significantes na sua atividade, sugerindo mais mecanismos para entender a melhora clínica de animais doentes, vista após o tratamento com este medicamento.

Encephalitozoon cuniculi (E.cuniculi) is a fungus that acts as an intracellular pathogen and infects different cell types. In the rabbit and immunosuppressed animals from other species, including humans, it parasites neural tissues and cause a very characteristic neurological syndrome, being this infection a zoonotic concern. Herein, the aim was to evaluate the activity of macrophages infected with E. cuniculi after treatment with high dilutions of Phosphorus in vitro. For this, cultures of macrophages RAW 264.7 and E. cuniculi exposed to different high dilutions of Phosphorus were analyzed according the following parameters: phagocytosis, lysosome activity, cytokines/chemokines production and ultrastructure analysis. The control solution was the vehicle used to produce the matrix of the tested medicines (30% alcohol diluted 1:100 in water, being 0.06% the final alcohol concentration). Evaluations were performed at 01 and 24 hours post-infection. Phagocytosis and the lysosome activity were evaluated using, respectively, calcofluor and acridine orange staining methods, followed by automatic image analysis (Ofline Metamorph®). The cytokine production was evaluated using the MAGPIX-LUMINEX system. The experiments were done in triplicate. The vehicle itself could increase IL6, TNF alpha and MCP1 production (p<0.04), reducing the number of phagocyted parasites (p<0.001). A transitory increase of RANTES was seen after 1 hour of treatment with Phosphorus 200cH, followed by increase of the lysosome activity in the first and 24 hours of treatment (p<0.002). The ultra-structural features of internalized parasites after Phosphorus 200cH treatment show evidences of more intense parasite digestion activity in relation to the cells treated with the vehicle only. The results show that the treatment of infected macrophages with Phosphorus 200cH causes significant changes in their activity, suggesting some mechanisms to understand the clinical improvement of sick animals, seen after the treatment with this medicine.