Clinical safety of oral licomycin treatment in Nile tilapia (Oreochromis niloticus) / Segurança clínica do tratamento via oral com lincomicina em tilapias (Oreochromis niloticus)

Lincomycin is a broad-spectrum antimicrobial acting against Gram-positive bacteria, widely used in veterinary medicine. In fish, there are only limited in vitro data, thus requiring the design of effective therapeutic protocols for their use in aquatic organisms. In this context, the objective was to evaluate the clinical safety of lincomycin treatment, administered orally in tilapia, through hematological, biochemical and somatic index evaluation. A total of 136 tilapia (+100g) were randomly distributed in 17 tanks (100L of water, n=8) to constitute the following treatments: TO (control group, not treated with lincomycin); T1, T2, T3 (treated with 10, 20 and 40mg/kg¹ of lincomycin b.w., respectively) and T4 physiological standard (reference values). Eight animals were sampled per treatment in 4 periods: 2, 4 and 8 days post-treatment (DPT), and a group that was treated for 8 days with the drug and then treated only with commercial feed until the 12th day (recovery period). Tilapia treated with lincomycin had no difference in the hematological and leukocyte evaluation, in the hepatic, renal and splenic somatic index. However, they presented a transient increase in the values of ALT, AST, cholesterol, triglycerides and creatinine, which returned to normal levels after the period of recovery (12DPT). Furthermore, an increase in total protein, albumin and globulin levels was observed in treated animals. It is concluded that although there were some transient changes during the experiment, lincomycin has a good clinical safety margin at doses of 10, 20 and 40mg/Kg¹ b.w. for Nile tilapia.

A lincomicina é um antimicrobiano de amplo espectro atuando contra bactérias gram-positivas, amplamente utilizada na medicina veterinária. Em peixes existem apenas dados limitados in-vitro, necessitando assim, de delineamento de protocolos terapêuticos eficazes para seu uso em organismos aquáticos. Desse modo, objetivou-se avaliar a segurança clínica do tratamento com lincomicina, administrada por via oral em tilápias, por meio da avaliação hematológica, bioquímica e indice somático hepático, renal e esplênico. Foram utilizadas 136 tilápias (±100g), distribuídas aleatoriamente em 17 tanques (100L de água, n=8) para constituir as repetições dos diferentes tratamentos: TO (grupo controle, não tratado com lincomicina); T1, T2, T3 (tratados com 10, 20 e 40mg/kg de p.v. de lincomicina, respectivamente) e T4 padrão fisiológico (valores de referência). Oito animais foram amostrados por tratamento em 4 períodos: 2, 4 e 8 dias pós-tratamento (DPT) com lincomicina, e um grupo que foi tratado por 8 dias com o fármaco e após isso tratado apenas com ração comercial até o 12º dia (período de recuperação). Tilápias tratadas com lincomicina não tiveram diferença na avaliação hematológica e leucocitária, no índice somático hepático, renal e esplênico, entretanto, apresentaram um aumento transitório nos valores de ALT, AST, colesterol, triglicérides e creatinina, que retornaram aos níveis normais após o período de recuperação (12DPT). Ademais, foram observados um incremento nos níveis de proteína total, albumina e globulina nos animais tratados. Conclui-se que embora tenha ocorrido algumas alterações transitórias ao decorrer do experimento, a lincomicina apresenta boa margem de segurança clinica nas doses de 10, 20 e 40mg/Kg¹ p.v para tilápia do Nilo.

Clinical safety of treatment with Zileuton, 5-Lox inhibitor, during acute inflammatory reaction in Nile Tilapia (Oreochromis niloticus) / Segurança clínica do tratamento com Zileuton, inibidor 5-Lox, durante reação inflamatória aguda em Tilápia do Nilo (Oreochromis niloticus)

Zileuton is an inhibitor of the 5-lipoxygenase enzyme that transforms essential fatty acid (EFA) substrates into leukotrienes (LTB4, LTC4, LTD4 and LTE4), but little is known about the use of this drug in teleost fish. Therefore, the objective of this study was to evaluate the clinical safety of treatments with 2,25 mg and 4,50 mg of zileuton/Kg-1 (bodyweight), administered orally in the diet, through biochemical and hematological analysis during the acute inflammatory reaction in Nile tilapia (Oreochromis niloticus), induced by Aeromonas hydrophila bacterins. The study used eighty tilapias, conditioned in 20 tanks (n=4), constituting the following treatments: T0 (control), T1 (2,25 mg zileuton) and T2 (4,50 mg zileuton), being sampled eight animals per treatment in three periods: 6, 24 and 48 hours post-inoculation, and a 10th group consisting of fish without any type of stimulus to obtain the reference values. In order to evaluate and determine the blood count and serum biochemical, it was necessary to collect blood samples. The hematology results of the tilapia treated with zileuton did not reveal alterations between tilapia subjected to different treatments and control fish (T0). The liver cytotoxicity analysis of tilapias treated with zileuton did not reveal significant (p≥0,05) alterations in AST and ALT serum enzymatic activity. The study of tilapia blood total protein showed decrease in the T1 group at 48 HPI. As the treatment time progressed, the results indicated decrease in the serum albumin levels for T2 group at 24 HPI. The determination of serum biochemichal of creatinine, cholesterol, triglycerides, and glucose did not differ statistically between treatments. The results observed in the hematological and biochemical analyzes allows to conclude that zileuton administered orally, at doses of 2,25 and 4,50 mg/Kg-1 (body weight) demonstrated to be clinically safe.(AU)

Safety of oral doxycycline treatment in Nile tilapia, Oreochromis niloticus / Segurança do tratamento oral com doxiciclina em tilapia do Nilo, Oreochromis niloticus

This study aimed to evaluate the clinical safety of doxycycline treatment (Sandoz Pharmacetical Industry from Brazil Ltd.), administered orally incorporated into the feed of Nile tilapia, Oreochromis niloticus. For this purpose, 75 Nile tilapia (±300g) from the same spawning were randomly distributed in 15 tanks (n=5), containing 100 L of water each, supplied with running water free from chlorine, to establish the following treatments: TO (Control - not treated with doxycycline); T1, T2, T3 and T4 (treated with 10, 20, 40 and 80mg of doxycycline/kg of body weight, respectively), in which 5 animals per treatment were sampled in 3 periods: 2, 4 and 8 days post-treatment (DPT). Blood samples were collected for hemogram determination and serum biochemical evaluation, as well as spleen, liver and kidneys (cranial and caudal) for somatic and histopathological evaluation. The results showed no significant difference among treatments in the serum values of creatinine, total protein, cholesterol, triglycerides, globulin, glycemia and alkaline phosphatase enzyme activity. However, serum levels of AST (aspartate aminotransferase) were significantly higher (P<0.05) in animals treated with 80 mg of doxycycline in the longest period of treatment (8 days). In the hematological evaluation of tilapia treated with doxycycline, no significant changes (P>0.05) were observed in erythrocyte counts, hematocrit, MCV, HCM and CHCM values. Doxycycline-treated tilapia did not present significant difference in the somatic analysis of spleen, liver and kidney when compared to control group. Therefore, the results demonstrated the clinical safety of oral treatment with doxycycline at doses of 10, 20, 40 and 80 mg/kg of b.w., although transient changes in liver functionality were observed after eight days of treatment with the dose of 80mg/kg.

Este estudo teve por objetivo avaliar a segurança clínica do tratamento com doxiciclina (Sandoz do Brasil Indústria Farmacêutica Ltda.), administrada via oral incorporada à ração em tilápias do Nilo, Oreochromis niloticus. Para tal, foram utilizadas 75 tilápias no Nilo (±300g) oriundas da mesma desova foram distribuídas aleatoriamente em 15 tanques (n=5), contendo 100 L de água cada, abastecidos com água corrente desprovida de cloro, para constituir os seguintes tratamentos: TO (Controle - não tratado com doxiciclina); T1, T2, T3 e T4 (tratados com 10, 20, 40 e 80mg de doxiciclina/kg de p.v., respectivamente. 5 animais por tratamento foram amostrados em 3 períodos: 2, 4 e 8 dias pós-tratamento (DPT). Foram coletadas amostras de sangue para determinação do hemograma e avaliação do bioquímico sérico, além de órgãos como baço, fígado e rins (cranial e caudal) para avaliação somática e histopatológica. Os resultados não mostraram diferença significativa entre os tratamentos nos valores séricos de creatinina, proteína total, colesterol, triglicerídeos, globulina, glicemia e atividade da enzima fosfatase alcalina. No entanto, os níveis séricos de AST (aspartato aminotransferase) foram significativamente maiores (P<0,05) nos animais tratados com 80 mg de doxiciclina no período mais longo de tratamento (8 dias). Na avaliação hematológica de tilápias tratadas com doxiciclina, não foram observadas alterações significativas (P>0,05) nas contagens de eritrocitos, valores de hematocrito, VCM, HCM e CHCM. Tilápias tratadas com doxiciclina não apresentaram diferença significativa na análise somática do baço, fígado e rim quando comparadas aos animais do grupo controle. Portanto, os resultados demonstraram a segurança clínica do tratamento oral com doxiciclina nas doses de 10, 20, 40 e 80 mg/kg de peso corporal, embora alterações transitórias na funcionalidade hepática tenham sido observadas após oito dias de tratamento com a dose de 80mg/kg.

Nanopartículas de quitosana para encapsular o vírus da bronquite infecciosa aviária (vbi)

Em busca de adjuvantes de nova geração para uso na formulação de vacinas contra patógenos virais, o trabalho teve como objetivo preparar nanopartículas de quitosana para encapsular o VBI. Foi utilizado uma suspensão da estirpe H120 atenuada do VBI em líquido córion-alantóide (LCA) para a formulação das nanopartículas por meio da técnica de gelificação iônica. Foram testadas diferentes concentrações de quitosana, ácido acético e tripolifosfato de sódio (TPP) e em diferentes condições de pH. Para o preparo das nanopartículas, um volume da suspensão viral em LCA foi adicionado a 10 volumes da solução de quitosana previamente preparada e, a essa mistura depois de agitada, foram adicionados 5 volumes de TPP, deixando-se essa mistura sob agitação por mais 10 minutos. As nanopartículas foram separadas por duas centrifugações seguidas, sendo armazenado o sobrenadante enquanto que o precipitado, contendo as nanopartcículas foi ressuspendido em PBS. O tamanho das nanopartículas foi medido no aparelho Zetasizer e a eficiência do encapsulamento foi avaliada pela dosagem de proteína presente no sobrenandante através da técnica de Bradford e pela detecção do RNA genômico viral por RT-PCR. Os resultados demonstraram que as concentrações de quitosana e TPP e o pH influenciaram na geração das nanopartículas, sendo que a melhor formulação foi obtida com a quitosana a 0,2%, o TPP a 0,2% e em p

Proposed method for agglutinating antibody titer analysis and its use as indicator of acquired immunity in pacu, Piaractus mesopotamicus / Aglutinante de anticorpos como indicador de imunidade adquirida de pacu Piaractus mesopotamicus

Antibody can be assessed by agglutinating antibody titer which is a quantitative measure of circulating antibodies in serum from fish previously immunized. The antibody evaluation has been performed with different fish species, and is considered a reliable method that can be applied to confirm several hypothesis regarding acquired immunity, even in conjunction with precise methods to describe immune mechanisms. In order to provide appropriate analytical methods for future studies on the specific immune system of native fish, the present study standardized on assay to measure the serum agglutinating antibody titer produced after immunization with inactivated A. hydrophila and levamisole administration in pacu. It was possible to determine the agglutinating antibodies titer in a satisfactorily way in pacu immunized with inactive A. hydrophila, and the highest titers were observed on fish fed with levamisole.(AU)

Os anticorpos podem ser avaliados pelo título aglutinante de anticorpos, que é uma medida quantitativa de anticorpos no soro de peixe previamente imunizados. A determinação do título de anticorpos foi realizada com diversas espécies de peixes e é considerado um método confiável que pode ser aplicado para confirmar diversas hipóteses que envolvam o sistema adquirido de defesa, mesmo em conjunto com métodos precisos, para descrever mecanismos imunes. A fim de prover métodos analíticos adequados para futuros estudos sobre o sistema imune específico de peixes nativos, o presente estudo aperfeiçoou o ensaio para avaliar o título aglutinante de anticorpos em soro de pacu imunizados com A. hydrophila e alimentados com levamisol. Foi possível determinar o título aglutinante de anticorpos de forma satisfatória, em pacus imunizados com A. hydrophila inativa, e os maiores títulos foram observados em peixes alimentados com levamisol.(AU)

Desenvolvimento de elisa competitivo com concanavalina a (c-con a-elisa) para o sorodiagnóstico da doença de newcastle em pombos de vida-livre / development of concanavalin a competitive elisa (c-con a-elisa) for serodiagnosis of newcastle disease in ..

A Doença de Newcastle é uma enfermidade viral e de rápido poder de disseminação, acometendo uma ampla gama de espécies de aves domésticas e silvestres, em adição às da espécie Gallus gallus. Numerosos testes sorológicos foram desenvolvidos para detectar anticorpos contra o vírus da doença de Newcastle (VDN), como o teste de inibição da hemaglutinação (HI), que apresenta dificuldades de padronização para análise de soros de algumas espécies de aves silvestres e o método indireto de ELISA. Este último, entretanto, não é adequado para a detecção de anticorpos da maioria das espécies de aves não galiformes, uma vez que as imunoglobulinas dessas aves não reagem de forma cruzada com conjugados imunoenzimáticos anti-IgG de galinha, usados nos kits comerciais de ELISA para o VDN. Como ensaio sorológico alternativo, o método de C-CON A-ELISA foi desenvolvido nesse estudo para a detecção e quantificação de anticorpos contra VDN em soros de pombos de vida livre. Na compara&c

Um novo protectotipo de um genótipo variante do virus da bronquite infecciosa (vbi) isolado no brasil definido pelo teste de proteção vacinal com a estirpe massachussetts h120 / a new protectotype of a variant genotype of infectious bronchitis ..

Um grande número de genótipos e fenótipos do VBI (sorotipos e patótipos) aparece com frequência em todo o mundo, incluindo as cepas variantes encontradas no Brasil, apesar da vacinação rotineira que acontece neste país com estirpes do VBI Massachusetts. No entanto, agrupar isolados do VBI em imunotipos ou protetotipos é mais relevante do ponto de vista prático, porque fornece informações diretas sobre a eficácia de uma vacina contra o VBI. Cepas do VBI que induzem proteção contra o outro pertencem ao mesmo imunotipo. Neste estudo, a proteção induzida pela vacina da estirpe Massachusetts (H120) foi avaliada após o desafio com uma estirpe variante do VBI isolado no Brasil. Doze frangos LPE (livres de patógenos específicos) foram vacinados via óculo-nasal aos 21 dias de idade e desafiados com isolados de campo 21 dias pós-vacinação. Três frangos foram sacrificados aos 4, 7, 11, 14 dias pós-infecção (dpi). Os sinais clínicos foram registrados e amostras de tecidos foram coletadas da traqueia, rins e gônadas, e avaliadas quanto à presença d

Desenvolvimento da técnica de semi-nested-rt-pcr para a detecção do virus da doença de newcastle em pombos capturados em jaboticabal-sp, brasil / development of semi-nested-rt-pcr technique for the detection of newcastle disease virus in pigeons ..

O vírus da doença de Newcastle (VDN) é o agente causador de uma das mais importantes doenças de aves domésticas e silvestres e representa uma ameaça para a avicultura. Os pombos (Columba livia) são susceptíveis ao VDN, sendo considerados disseminadores em potencial desse vírus e por esse motivo tem um importante papel na cadeia epidemiológica dessa enfermidade que é capaz de causar impactos econômicos negativos para a indústria avícola. Este estudo teve por objetivo investigar a presença do VDN em suabes cloacais de 101 pombos capturados em Jaboticabal-SP, com base na técnica molecular Semi-nested-RT-PCR, tendo como alvo a amplificação da região codificadora da proteína de Fusão de 196 pb.  Foram avaliadas quatro combinações de primers externos com os internos na técnica de Semi-Nested-RT-PCR, testando-as em diluições seriadas de amostras de líquido córion-alantóide (LCA) infectado com a estirpe LaSota do VDN. Escolhendo-se a combinação de primers externos e internos que revelou uma maior sensibilidade analítica para ser ap

Detecção de coronavírus em aves silvestres da região nordeste do estado de são paulo, brasil, por técnicas moleculares de rt-pcr e nested-pcr / detection of coronavirus by rt-pcr and nested-pcr in wild birds from northeastern são paulo state, brazil

          Os Coronavírus são um dos mais importantes patógenos virais causadores de doenças infecciosas em mamíferos e aves, especialmente os coronavírus aviários, como o vírus da bronquite infecciosa das galinhas (VBI). Um amplo conhecimento sobre as características genotípicas e fenotípicas está disponível para os coronavírus oriundos de aves domésticas. No entanto, em se tratando de aves silvestres, pouco é conhecido, principalmente no Brasil; apesar de já ter sido demonstrado que algumas espécies dessas aves podem ser portadoras assintomáticas desses vírus, inclusive do VBI, que é um importante patógeno para as galinhas domésticas, especialmente as destinadas à avicultura industrial. Assim, é importante que seja melhor compreendido o papel das aves silvestres na epidemiologia da infecção por coronavírus aviários. Dessa forma, este estudo foi realizado com o objetivo de investigar a presença de coronavírus do grupo 3, com base em técnicas moleculares como RT-PCR e Nested-PCR e

Distribuição tecidual e carga viral de uma variante brasileira do vírus da bronquite infecciosa (vbi) após infecção experimental em galinhas / tissue distribution and viral load of a brazilian variant of infectious bronchitis virus (ibv) after ..

O IBV é um coronavírus (CoV) que infecta aves da espécie Gallus gallus, causando perdas econômicas relevantes para a produção de aves. Os COVs têm uma elevada taxa de variabilidade genética, levando ao aparecimento de estirpes variantes genéticas que podem apresentar diferentes patogenicidades e tropismo do tecido. Este estudo tem como objetivo avaliar um isolado Brasileiro do IBV (IBVPR-12), anteriormente caracterizados como genótipo S1-variante, a fim de determinar a distribuição do tecido após a infecção experimental em galinhas Leghorn da cor branca, livre de patógenos específicos. A carga viral foi medida pelo tempo real de RT-qPCR. Amostras de traquéia, pulmão, baço, rins, gônadas e amígdalas cecais (CT) foram coletadas, em intervalos de 4, 7, 11, 14 e 21 dias após a infecção (dpi). O pico de replicação viral na traquéia foi detectado aos 4 dpi, recusando-se a concluir a limpeza viral em 21 dpi. O pulmão apresentou a maior carga viral aos 7 dpi e replicação do vírus inferior foi detectado até 21 dpi. No entanto, as car

Análise filogenética de isolados do vírus da bronquite infecciosa aviária (vbi) no brasil com base na sequência 3’-terminal do gene da nucleoproteína / Phylogenetic analysis of isolates of avian infectious bronchitis virus (ibv)in brazil based on the 3'-terminal sequence of the nucleoprotein gene

A bronquite infecciosa é causada pelo VBI, que é classificado no gênero Gammacoronavirus da Família Coronaviridae. Essa enfermidade está distribuída mundialmente e destaca-se como um dos mais importantes problemas sanitários para o plantel avícola industrial. Recentemente tem sido identificado no Brasil um número elevado de variantes do VBI, diferindo na análise filogenética com base no gene S1 de estirpes Americanas, Europeias, Asiáticas e Australianas. No entanto, pouco tem sido investigado com relação a outros genes codificadores de proteínas importantes como a nucleoproteina (N), que é fator chave nos processos de replicação e montagem de novas partículas virais, e contém epítopos importantes para interação com as células T e B. O objetivo do presente estudo foi determinar as seqüências 3’-terminal do gene da proteina N de isolados do VBI no Brasil e compará-las com as de estirpes do VBI de outras regiões do mundo. Para tanto, foram submetidos à análise molecular, 15 isolados do VBI obtidos durante o período de 1988 a 2000, de surtos à campo da Bronquite Infecciosa (BI), em aves de corte ou de postura das regiões Sul e Sudeste do Brasil. A análise filogenética de sequências parciais do gene N resultou na segregação dos 15 isolados brasileiros do VBI em cinco grupos diferentes, sendo que três desses grupos são relacionados a estirpes do genótipos Massachusetts, enquanto que os outros dois grupos são associados aos genótipos Connecticut ou Variante Brasileira. Esses grupos genotípicos coincidiram na sua maior parte com os que foram previamente determinados pela análise filogenética com base no gene S1. Concluindo, a análise filogenética do gene N é capaz de diferenciar estirpes brasileiras do VBI e avaliar a sua evolução, especialmente nos casos em que a amplificação do gene S1 é mais difícil por causa da sua variabilidade entre estirpes muito diferentes do VBI.

Infectious bronchitis is caused by IBV, which is classified in the genus Gammacoronavirus, Family Coronaviridae. This disease is distributed worldwide and stands as one of the most important health problems for the poultry industry. Recently, researchers in Brazil have identified a large number of IBV variants, the phylogenetic analysis based on the S1 gene shows that they differ from the American, European, Asian and Australian strains. However, little research has been conducted about other encoding genes of important proteins such as the nucleoprotein (N), which is a key factor in replication and assembly processes of new viral particles, and contains epitopes important for interaction with T and B cells. The aim of this study was to determine the 3'-terminal sequences of the N protein gene isolated from IBV in Brazil and compare them with those of IBV strains from other regions of the world. So, 15 IBV isolates obtained from 1988 to 2000, during outbreaks of Infectious Bronchitis (IB) in broilers or laying birds in Southern and Southeastern Brazil, were submitted to molecular analysis. Phylogenetic analysis of partial sequences of the N gene resulted in the separation of the 15 Brazilian IBV isolates in five different groups while three of these groups are related to strains of the Massachusetts genotypes, whereas the other two groups are associated with the Connecticut genotypes or a Brazilian variant. These genotypic groups mostly coincided with those previously determined by phylogenetic analysis based on the S1 gene. In conclusion, the phylogenetic analysis of the N gene can differentiate Brazilian strains of IBV and evaluate its development, especially in cases where the S1 gene amplification is more difficult due to wide variability between different IBV strains.

Novo imunotipo de um genótipo variante do virus da bronquite infecciosa (vbi) isolado no Brasil definido pelo teste de proteção vacinal com a estirpe Massachussetts h120 / A new protectotype of a variant genotype of infectious bronchitis virus (ibv) isolated in Brazil defined by test of protection with Massachusetts h120 vaccine strain

Um grande número de genótipos e fenótipos do VBI (sorotipos e patótipos) aparece com frequência em todo o mundo, incluindo as cepas variantes encontradas no Brasil, apesar da vacinação rotineira que acontece neste país com estirpes do VBI Massachusetts. No entanto, agrupar isolados do VBI em imunotipos é mais relevante do ponto de vista prático, porque fornece informações diretas sobre a eficácia de uma vacina contra o VBI. Cepas do VBI que induzem proteção contra o outro pertencem ao mesmo imunotipo. Neste estudo, a proteção induzida pela vacina da estirpe Massachusetts (H120) foi avaliada após o desafio com uma estirpe variante do VBI isolado no Brasil. Doze frangos LPE (livres de patógenos específicos) foram vacinados via óculo-nasal aos 21 dias de idade e desafiados com isolados de campo 21 dias pós-vacinação. Três frangos foram sacrificados aos 4, 7, 11, 14 dias pós-infecção (dpi). Os sinais clínicos foram registrados e amostras de tecidos foram coletadas da traqueia, rins e gônadas, e avaliadas quanto à presença de lesões por exame histopatológico, à carga viral por RT-qPCR, ao tropismo viral por imuno-histoquímica, e estase traqueal ciliar. Sintomas respiratórios leves foram observados em aves vacinadas e desafiadas. Além disso, a VBI foi detectada em todos os órgãos de aves vacinadas, embora as cargas virais mais elevadas estivessem presentes em rins e testículos. As lesões traqueais foram mais proeminentes entre 4-7 dpi. Os rins apresentavam uma nefrite moderada entre 4-11 dpi, e o testículo apresentou degeneração das células dos túbulos seminíferos entre 7-14 dpi. Assim, a vacina H120 promoveu apenas uma proteção parcial contra esta variante brasileira com relação à infecção da traqueia e dos rins e nenhuma proteção cruzada para a infecção dos testículos. Concluindo, este estudo caracterizou um novo imunotipo de um genótipo variante do isolado do VBI brasileiro no que diz respeito à estirpe da vacina Massachusetts, que é utilizada no Brasil atualmente.

A high number of IBV genotypes and phenotypes (serotypes and pathotypes) are frequently emerging worldwide, including the variant strains found in Brazil, despite the routine vaccination in this country with Massachusetts IBV vaccine strains. However, grouping IBV strains into immunotypes or protectotypes is more relevant from a practical point of view, because it provides direct information about the efficacy of an IBV vaccine. IBV strains that induce protection against each other belong to the same protectotype. In this study, we conducted the evaluation of protection induced by the Massachusetts (H120) vaccine strain upon challenge with a variant strain of IBV isolated in Brazil. Twelve SPF (specific pathogen free) chickens were vaccinated with by oculo-nasal route at 21 days old and challenged with field isolate 21 days post-vaccination. Three birds were euthanized at 4, 7, 11, 14 days post-infection (dpi). Clinical signs were recorded and tissue samples were collected from trachea, kidney and gonads, and were evaluated for the presence of lesions by histopathology, viral load by RT-qPCR, viral tropism by immunohistochemistry, and tracheal ciliary stasis. Mild respiratory symptoms were observed in vaccinated and challenged chickens. Additionally, IBV was detected in all organs of vaccinated birds, though higher viral loads were present in kidneys and testicles. The tracheal lesions were more prominent between 4-7 dpi. The kidney showed a moderate nephritis between 4-11 dpi, and the testicle showed degeneration of the seminiferous tubules cells between 7-14 dpi. Thus, the H120 vaccine induced only a partial protection against this Brazilian variant isolate with regard to the infection of trachea and kidney and no cross-protection to the infection of testicles. In conclusion, a new protectotype. of a variant genotype of a Brazilian IBV isolate was characterized in this study with regard to Massachusetts vaccine strain which is currently used in Brazil.

Respostas imunes humorais homóloga e heteróloga induzidas por estirpes vacinal h120 e variante de campo do vírus da bronquite infecciosa aviária (vbi) / homologous and heterologous humoral immune responses induced by h120 vaccine and field variant ..

A proteção contra as cepas homólogas de IBV é geralmente obtida pela imunização com vacinas contendo cepas atenuadas. No entanto, a variação em algumas proteínas estruturais do IBV resulta em falha da vacina contra cepas heterólogas circulantes no campo. Neste estudo, foram medidas as respostas imunitárias humorais, utilizando um teste ELISA em aves vacinadas e não vacinadas com a cepa Massachusetts H120 e desafiados com uma cepa virulenta de Massachusetts, ou com uma cepa variante. Os grupos experimentais de galinhas SPF vacinadas ou não com a cepa Massachusetts no dia 2 e desafiados no dia 21 com a cepa variante, ou com a cepa virulenta de Massachusetts, foram testadas. Amostras de sangue e lágrimas foram coletadas aos 4, 7, 11, 14 e 21 dias pós-infecção (dpi), para medir os níveis de IgM, IgA e anticorpos anti-IBV IgG. Os resultados mostraram que a IgM sérica e lacrimal, começou a aumentar no quarto dpi, atingindo o pico de concentração no sétimo dpi e em seguida diminuído para os níveis basais até 21 dpi. A IgA foi detectada somente na lágrima, alcançando seu pico aos 14

Novo imunotipo de um genótipo variante do virus da bronquite infecciosa (vbi) isolado no Brasil definido pelo teste de proteção vacinal com a estirpe Massachussetts h120 / A new protectotype of a variant genotype of infectious bronchitis virus (ibv) isolated in Brazil defined by test of protection with Massachusetts h120 vaccine strain

Um grande número de genótipos e fenótipos do VBI (sorotipos e patótipos) aparece com frequência em todo o mundo, incluindo as cepas variantes encontradas no Brasil, apesar da vacinação rotineira que acontece neste país com estirpes do VBI Massachusetts. No entanto, agrupar isolados do VBI em imunotipos é mais relevante do ponto de vista prático, porque fornece informações diretas sobre a eficácia de uma vacina contra o VBI. Cepas do VBI que induzem proteção contra o outro pertencem ao mesmo imunotipo. Neste estudo, a proteção induzida pela vacina da estirpe Massachusetts (H120) foi avaliada após o desafio com uma estirpe variante do VBI isolado no Brasil. Doze frangos LPE (livres de patógenos específicos) foram vacinados via óculo-nasal aos 21 dias de idade e desafiados com isolados de campo 21 dias pós-vacinação. Três frangos foram sacrificados aos 4, 7, 11, 14 dias pós-infecção (dpi). Os sinais clínicos foram registrados e amostras de tecidos foram coletadas da traqueia, rins e gônadas, e avaliadas quanto à presença de lesões por exame histopatológico, à carga viral por RT-qPCR, ao tropismo viral por imuno-histoquímica, e estase traqueal ciliar. Sintomas respiratórios leves foram observados em aves vacinadas e desafiadas. Além disso, a VBI foi detectada em todos os órgãos de aves vacinadas, embora as cargas virais mais elevadas estivessem presentes em rins e testículos. As lesões traqueais foram mais proeminentes entre 4-7 dpi. Os rins apresentavam uma nefrite moderada entre 4-11 dpi, e o testículo apresentou degeneração das células dos túbulos seminíferos entre 7-14 dpi. Assim, a vacina H120 promoveu apenas uma proteção parcial contra esta variante brasileira com relação à infecção da traqueia e dos rins e nenhuma proteção cruzada para a infecção dos testículos. Concluindo, este estudo caracterizou um novo imunotipo de um genótipo variante do isolado do VBI brasileiro no que diz respeito à estirpe da vacina Massachusetts, que é utilizada no Brasil atualmente.(AU)

A high number of IBV genotypes and phenotypes (serotypes and pathotypes) are frequently emerging worldwide, including the variant strains found in Brazil, despite the routine vaccination in this country with Massachusetts IBV vaccine strains. However, grouping IBV strains into immunotypes or protectotypes is more relevant from a practical point of view, because it provides direct information about the efficacy of an IBV vaccine. IBV strains that induce protection against each other belong to the same protectotype. In this study, we conducted the evaluation of protection induced by the Massachusetts (H120) vaccine strain upon challenge with a variant strain of IBV isolated in Brazil. Twelve SPF (specific pathogen free) chickens were vaccinated with by oculo-nasal route at 21 days old and challenged with field isolate 21 days post-vaccination. Three birds were euthanized at 4, 7, 11, 14 days post-infection (dpi). Clinical signs were recorded and tissue samples were collected from trachea, kidney and gonads, and were evaluated for the presence of lesions by histopathology, viral load by RT-qPCR, viral tropism by immunohistochemistry, and tracheal ciliary stasis. Mild respiratory symptoms were observed in vaccinated and challenged chickens. Additionally, IBV was detected in all organs of vaccinated birds, though higher viral loads were present in kidneys and testicles. The tracheal lesions were more prominent between 4-7 dpi. The kidney showed a moderate nephritis between 4-11 dpi, and the testicle showed degeneration of the seminiferous tubules cells between 7-14 dpi. Thus, the H120 vaccine induced only a partial protection against this Brazilian variant isolate with regard to the infection of trachea and kidney and no cross-protection to the infection of testicles. In conclusion, a new protectotype. of a variant genotype of a Brazilian IBV isolate was characterized in this study with regard to Massachusetts vaccine strain which is currently used in Brazil.(AU)

Análise filogenética de isolados do vírus da bronquite infecciosa aviária (vbi) no brasil com base na sequência 3-terminal do gene da nucleoproteína / Phylogenetic analysis of isolates of avian infectious bronchitis virus (ibv)in brazil based on the 3'-terminal sequence of the nucleoprotein gene

A bronquite infecciosa é causada pelo VBI, que é classificado no gênero Gammacoronavirus da Família Coronaviridae. Essa enfermidade está distribuída mundialmente e destaca-se como um dos mais importantes problemas sanitários para o plantel avícola industrial. Recentemente tem sido identificado no Brasil um número elevado de variantes do VBI, diferindo na análise filogenética com base no gene S1 de estirpes Americanas, Europeias, Asiáticas e Australianas. No entanto, pouco tem sido investigado com relação a outros genes codificadores de proteínas importantes como a nucleoproteina (N), que é fator chave nos processos de replicação e montagem de novas partículas virais, e contém epítopos importantes para interação com as células T e B. O objetivo do presente estudo foi determinar as seqüências 3-terminal do gene da proteina N de isolados do VBI no Brasil e compará-las com as de estirpes do VBI de outras regiões do mundo. Para tanto, foram submetidos à análise molecular, 15 isolados do VBI obtidos durante o período de 1988 a 2000, de surtos à campo da Bronquite Infecciosa (BI), em aves de corte ou de postura das regiões Sul e Sudeste do Brasil. A análise filogenética de sequências parciais do gene N resultou na segregação dos 15 isolados brasileiros do VBI em cinco grupos diferentes, sendo que três desses grupos são relacionados a estirpes do genótipos Massachusetts, enquanto que os outros dois grupos são associados aos genótipos Connecticut ou Variante Brasileira. Esses grupos genotípicos coincidiram na sua maior parte com os que foram previamente determinados pela análise filogenética com base no gene S1. Concluindo, a análise filogenética do gene N é capaz de diferenciar estirpes brasileiras do VBI e avaliar a sua evolução, especialmente nos casos em que a amplificação do gene S1 é mais difícil por causa da sua variabilidade entre estirpes muito diferentes do VBI.(AU)

Infectious bronchitis is caused by IBV, which is classified in the genus Gammacoronavirus, Family Coronaviridae. This disease is distributed worldwide and stands as one of the most important health problems for the poultry industry. Recently, researchers in Brazil have identified a large number of IBV variants, the phylogenetic analysis based on the S1 gene shows that they differ from the American, European, Asian and Australian strains. However, little research has been conducted about other encoding genes of important proteins such as the nucleoprotein (N), which is a key factor in replication and assembly processes of new viral particles, and contains epitopes important for interaction with T and B cells. The aim of this study was to determine the 3'-terminal sequences of the N protein gene isolated from IBV in Brazil and compare them with those of IBV strains from other regions of the world. So, 15 IBV isolates obtained from 1988 to 2000, during outbreaks of Infectious Bronchitis (IB) in broilers or laying birds in Southern and Southeastern Brazil, were submitted to molecular analysis. Phylogenetic analysis of partial sequences of the N gene resulted in the separation of the 15 Brazilian IBV isolates in five different groups while three of these groups are related to strains of the Massachusetts genotypes, whereas the other two groups are associated with the Connecticut genotypes or a Brazilian variant. These genotypic groups mostly coincided with those previously determined by phylogenetic analysis based on the S1 gene. In conclusion, the phylogenetic analysis of the N gene can differentiate Brazilian strains of IBV and evaluate its development, especially in cases where the S1 gene amplification is more difficult due to wide variability between different IBV strains.(AU)

Clonagem, expressão e caracterização da nucleoproteína recombinante do vírus da bronquite infecciosa em Escherichia coli e em Pichia pastoris / Cloning, expression, and characterization of the nucleocapsid protein of infectious bronchitis virus in Escherichia coli and Pichia pastoris

O gene da proteína de nucleocapsídeo (1.230 pb) da estirpe M41 do vírus da bronquite infecciosa (VBI) foi amplificado pelas reações de transcrição reversa e em cadeia da polimerase (RT-PCR) e clonado, em seguida, em dois sistemas; pET28a - Escherichia coli e pFLD -Pichia pastoris. Os produtos recombinantes construídos para expressão (pET28a-N ou pFLD-N) foram identificados por análises de PCR e de sequenciamento de nucleotídeos. Os clones transformantes da linhagem BL21 de E. coli e da linhagem GS115 de P. pastoris foram submetidos aos protocolos apropriados de indução. A expressão da proteína N de fusão com etiqueta de poli-histidina e com massa molecular de 54 kDa foi determinada pelas técnicas de SDS-PAGE e de Western blotting, confirmando-se que ambas proteínas N recombinantes apresentaram tamanhos e antigenicidade compatíveis com a proteína N nativa do próprio VBI. O sistema E. coli expressou uma quantidade relevante da proteína N recombinante, enquanto que o sistema P. pastoris produziu uma baixa recuperação dessa proteína recombinante. A proteína N recombinante gerada pelo sistema bacteriano foi purificada em resina de níquel-sepharose. O conjunto de resultados indica que o sistema de expressão constituído por pET28a ­ E. coli é mais efetivo para produzir a proteína N recombinante do VBI destinada ao uso como antígeno para detectar anticorpos anti-virais específicos em ensaios de imunodiagnóstico para essa infecção viral.

The nucleocapsid protein (N) gene (1,230 bp) of the M41 strain of infectious bronchitis virus (IBV) was amplified by reverse transcriptase-polymerase chain reaction (RT-PCR), and cloned in two systems; pET28a Escherichia coli and pFLD Pichia pastoris. The recombinant expression constructs (pET28a-N or pFLD-N) were identified by PCR and sequencing analysis. The transformant clones of BL21 strain of E. coli or GS115 of P. pastoris were submitted to appropriate inducting protocols. Expression of histidine-tagged fusion N proteins with a molecular mass of 54 kDa was determined by SDS-PAGE and Western blotting analysis, confirming that both recombinant N proteins were comparable in size and antigenicity to native IBV N protein. The E. coli system overexpressed the recombinant N protein, while the P. pastoris system produced a low yield of this recombinant protein. The bacteria expressed N protein was purified by chromatography on nickel-sepharose resin. These results indicated that the pET28a E. coli expression system is more effective to generate N recombinant protein for using as an antigen to detect anti-IBV antibodies in immuno-assays for this viral infection.

Clonagem e expressão do gene da glicoproteína S1 do vírus da bronquite infecciosa das galinhas em Pichia pastoris / Cloning and expression in Pichia pastoris of the S1 glycoprotein gene of the chicken infectious bronchitis virus

Variações genética e antigênica são observadas com frequência elevada entre estirpes do VBIG e envolvem principalmente a glicoproteína S1. Com o objetivo de contribuir com a disponibilidade de ferramentas para o imunodiagnóstico e a imunoprofilaxia da bronquite infecciosa das galinhas foi desenvolvida uma metodologia para expressão recombinante da glicoproteína S1 na levedura Picchia pastoris. O cDNA do gene codificador dessa proteína foi obtido a partir de RNA viral de ovos embrionados infectados com a estirpe M41 do VBIG submetido à transcrição reversa (RT) e reação em cadeia da polimerase (PCR), amplificando-se a sequência codificadora de S1 acrescida de extremidades compatíveis com a clonagem no vetor usado na transformação de leveduras. A indução com metanol resultou na produção de uma proteína detectada como banda única do tamanho previsto, em western-blot, no lisado celular das leveduras transformadas. A expressão em P. pastoris mostrou ser um método eficaz para a produção recombinante da proteína S1 do VBIG, com potencial para utilização em técnicas de imunodiagnóstico da bronquite infecciosa das galinhas.

Genetic and antigenic variation are very frequently observed among IBV strains and affect mainly the S1 glycoprotein. In order to contribute to the availability of tools for immunodiagnosis and immunoprophylaxis of chicken infectious bronchitis we developed an expression system for production of recombinant S1 glycoprotein in Pichia pastoris. We obtained the cDNA from viral RNA on embryonated eggs infected with the M41 strain of IBV, by reverse transcription (RT) and polymerase chain reaction (PCR), amplifying the S1 coding sequence with extremities compatible with the vector used to transform yeast. Induction with methanol led to the production of a protein with the predicted molecular weight that was detected by Western blot in the cell lysate of transformed yeast. Expression in P. pastoris proved to be an effective method for recombinant production of S1 protein from IBV, with potential for use in immuno-diagnosis of chicken infectious bronchitis virus.

CLONAGEM E EXPRESSÃO DO GENE DA GLICOPROTEÍNA S1 DO VÍRUS DA BRONQUITE INFECCIOSA DAS GALINHAS EM PICHIA PASTORIS

ABSTRACT Genetic and antigenic variation are very frequently observed among IBV strains and affect mainly the S1 glycoprotein. In order to contribute to the availability of tools for immunodiagnosis and immunoprophylaxis of chicken infectious bronchitis we developed an expression system for production of recombinant S1 glycoprotein in Pichia pastoris. We obtained the cDNA from viral RNA on embryonated eggs infected with the M41 strain of IBV, by reverse transcription (RT) and polymerase chain reaction (PCR), amplifying the S1 coding sequence with extremities compatible with the vector used to transform yeast. Induction with methanol led to the production of a protein with the predicted molecular weight that was detected by Western blot in the cell lysate of transformed yeast. Expression in P. pastoris proved to be an effective method for recombinant production of S1 protein from IBV, with potential for use in immuno-diagnosis of chicken infectious bronchitis virus.

RESUMO Variações genética e antigênica são observadas com frequência elevada entre estirpes do VBIG e envolvem principalmente a glicoproteína S1. Com o objetivo de contribuir com a disponibilidade de ferramentas para o imunodiagnóstico e a imunoprofilaxia da bronquite infecciosa das galinhas foi desenvolvida uma metodologia para expressão recombinante da glicoproteína S1 na levedura Picchia pastoris. O cDNA do gene codificador dessa proteína foi obtido a partir de RNA viral de ovos embrionados infectados com a estirpe M41 do VBIG submetido à transcrição reversa (RT) e reação em cadeia da polimerase (PCR), amplificando-se a sequência codificadora de S1 acrescida de extremidades compatíveis com a clonagem no vetor usado na transformação de leveduras. A indução com metanol resultou na produção de uma proteína detectada como banda única do tamanho previsto, em western-blot, no lisado celular das leveduras transformadas. A expressão em P. pastoris mostrou ser um método eficaz para a produção recombinante da proteína S1 do VBIG, com potencial para utilização em técnicas de imunodiagnóstico da bronquite infecciosa das galinhas.

CLONAGEM, EXPRESSÃO E CARACTERIZAÇÃO DA NUCLEOPROTEÍNA RECOMBINANTE DO VÍRUS DA BRONQUITE INFECCIOSA EM ESCHERICHIA COLI E EM PICHIA PASTORIS

ABSTRACT The nucleocapsid protein (N) gene (1,230 bp) of the M41 strain of infectious bronchitis virus (IBV) was amplified by reverse transcriptase-polymerase chain reaction (RT-PCR), and cloned in two systems; pET28a Escherichia coli and pFLD Pichia pastoris. The recombinant expression constructs (pET28a-N or pFLD-N) were identified by PCR and sequencing analysis. The transformant clones of BL21 strain of E. coli or GS115 of P. pastoris were submitted to appropriate inducting protocols. Expression of histidine-tagged fusion N proteins with a molecular mass of 54 kDa was determined by SDS-PAGE and Western blotting analysis, confirming that both recombinant N proteins were comparable in size and antigenicity to native IBV N protein. The E. coli system overexpressed the recombinant N protein, while the P. pastoris system produced a low yield of this recombinant protein. The bacteria expressed N protein was purified by chromatography on nickel-sepharose resin. These results indicated that the pET28a E. coli expression system is more effective to generate N recombinant protein for using as an antigen to detect anti-IBV antibodies in immuno-assays for this viral infection.

RESUMO O gene da proteína de nucleocapsídeo (1.230 pb) da estirpe M41 do vírus da bronquite infecciosa (VBI) foi amplificado pelas reações de transcrição reversa e em cadeia da polimerase (RT-PCR) e clonado, em seguida, em dois sistemas; pET28a - Escherichia coli e pFLD -Pichia pastoris. Os produtos recombinantes construídos para expressão (pET28a-N ou pFLD-N) foram identificados por análises de PCR e de sequenciamento de nucleotídeos. Os clones transformantes da linhagem BL21 de E. coli e da linhagem GS115 de P. pastoris foram submetidos aos protocolos apropriados de indução. A expressão da proteína N de fusão com etiqueta de poli-histidina e com massa molecular de 54 kDa foi determinada pelas técnicas de SDS-PAGE e de Western blotting, confirmando-se que ambas proteínas N recombinantes apresentaram tamanhos e antigenicidade compatíveis com a proteína N nativa do próprio VBI. O sistema E. coli expressou uma quantidade relevante da proteína N recombinante, enquanto que o sistema P. pastoris produziu uma baixa recuperação dessa proteína recombinante. A proteína N recombinante gerada pelo sistema bacteriano foi purificada em resina de níquel-sepharose. O conjunto de resultados indica que o sistema de expressão constituído por pET28a E. coli é mais efetivo para produzir a proteína N recombinante do VBI destinada ao uso como antígeno para detectar anticorpos anti-virais específicos em ensaios de imunodiagnóstico para essa infecção viral.