Detection of Mycobacterium bovis DNA in nasal swabs from tuberculous cattle by a multiplex PCR

Detection of tuberculosis in cattle relies on the intradermal tuberculin test (ITT), but a definitive diagnosis requires identification of the pathogen after the animal is slaughtered. DNA in nasal swabs from 50 cows was analyzed by m-PCR, targeting for the RvD1-Rv2031c and IS6110 sequences. M. bovis was identified in two of 34 tuberculous cows (5.9%). The use of mPCR of nasal swabs as an in vivo diagnostic tool for bovine tuberculosis is suggested.

Identification of Mycobacterium bovis Isolates by a multiplex PCR

Isolates from suggestive bovine tuberculosis lesions were tested by a multiplex polymerase chain reaction (m-PCR) targeting for RvD1Rv2031c and IS6110 sequences, specific for M. bovis and Mycobacterium tuberculosis complex respectively. The m-PCR successfully identified as M. bovis 88.24% of the isolates.

Colônias isoladas a partir de lesões sugestivas de tuberculose bovina foram testadas pela reação múltipla em cadeia da polimerase, usando oligonucleotídeos direcionados para as seqüências genômicas RvD1Rv2031c e IS6110, específicas para M. bovis e para o complexo Mycobacterium tuberculosis, respectivamente. A m-PCR identificou, com sucesso, 88,24% das colônias isoladas como M. bovis.

DETECTION OF Mycobacterium tuberculosis COMPLEX BY PCR-RESTRICTION FRAGMENT LENGTH POLYMORFISM ANALYSIS OF THE HSP65 GENE / DETECÇÃO DO COMPLEXO Mycobacterium tuberculosis NO LEITE PELA REAÇÃO EM CADEIA DA POLIMERASE SEGUIDA DE ANÁLISE DE RESTRIÇÃO DO FRAGMENTO AMPLIFICADO (PRA)

Mycobacterium bovis is a member of the M. tuberculosis complex, a group composed by species with high genetic homology. The pathogen is the etiological agent of bovine tuberculosis, an important zoonosis that is mainly transmitted by inhalation of infectious droplet nuclei or by ingestion of milk and crude milk derivative products from tuberculosis cows. The definitive identification of M. bovis, up to species level, is time consuming and difficult. In this work, the objective was to standardize a polymerase chain reaction followed by an enzyme restriction analysis in order to identify the M. tuberculosis complex in milk, without a microbiological isolation step. Reference strains and raw milk seeded with M. Bovis, were used as the starting material.  A 441pb fragment of the hsp65 gene was amplified and digested by two restriction enzymes BstEII and HaeIII. The obtained profile was used to identify the M. tuberculosis complex in milk. The minimum limit of detection of M. bovis in milk was 10CFU/mL. PRA methodology proved to be a specific and sensible method. It can be used to assist the microbiological and biochemical methods commonly used to identifying the bacilli in clinical samples, as milk  Key word: Detection limit (PRA), Mycobacterium tuberculosis complex, milk Mycobacterium bovis, Restriction Enzyme Analysis (PCR),

Mycobacterium bovis é membro do complexo Mycobacterium tuberculosis (MTBC), grupo este composto por espécies com grande homologia genética. É o agente etiológico da tuberculose bovina, importante zoonose transmissível ao homem, principalmente através da inalação do bacilo e/ou pelo consumo de leite e derivados não-pasteurizados provenientes de vacas tuberculosas. O objetivo deste estudo foi padronizar a identificação de micobactérias do complexo M. tuberculosis presentes no leite, por metodologia molecular. Fez-se a extração de DNA diretamente do leite contaminado e realizou-se a identificação molecular pela reação em cadeia da polimerase seguida de análise de restrição do fragmento amplificado (PRA). Utilizaram-se inhagens de referência e leite cru artificialmente contaminado com M. bovis IP. Um fragmento de 441pb do gene hsp65 foi amplificado, tratado com BstEII e HaeIII e empregou-se o perfil de restrição enzimática obtido para identificar o complexo M. tuberculosis no leite. Com a PRA foi possível detectar com especificidade e sensibilidade a presença de M. bovis em até 10 UFC/mL de leite. A metodologia padronizada poderá auxiliar os métodos microbiológicos e bioquímicos tradicionalmente usados na identificação do bacilo em alimentos suspeitos de contaminação, como, por exemplo, o leite proveniente de animais suspeitos de infecção por M. bovis.Palavras-chaves: Análise de pe

DETECTION OF Mycobacterium tuberculosis COMPLEX BY PCR-RESTRICTION FRAGMENT LENGTH POLYMORFISM ANALYSIS OF THE HSP65 GENE / DETECÇÃO DO COMPLEXO Mycobacterium tuberculosis NO LEITE PELA REAÇÃO EM CADEIA DA POLIMERASE SEGUIDA DE ANÁLISE DE RESTRIÇÃO DO FRAGMENTO AMPLIFICADO (PRA)

Mycobacterium bovis is a member of the M. tuberculosis complex, a group composed by species with high genetic homology. The pathogen is the etiological agent of bovine tuberculosis, an important zoonosis that is mainly transmitted by inhalation of infectious droplet nuclei or by ingestion of milk and crude milk derivative products from tuberculosis cows. The definitive identification of M. bovis, up to species level, is time consuming and difficult. In this work, the objective was to standardize a polymerase chain reaction followed by an enzyme restriction analysis in order to identify the M. tuberculosis complex in milk, without a microbiological isolation step. Reference strains and raw milk seeded with M. Bovis, were used as the starting material.  A 441pb fragment of the hsp65 gene was amplified and digested by two restriction enzymes BstEII and HaeIII. The obtained profile was used to identify the M. tuberculosis complex in milk. The minimum limit of detection of M. bovis in milk was 10CFU/mL. PRA methodology proved to be a specific and sensible method. It can be used to assist the microbiological and biochemical methods commonly used to identifying the bacilli in clinical samples, as milk  Key word: Detection limit (PRA), Mycobacterium tuberculosis complex, milk Mycobacterium bovis, Restriction Enzyme Analysis (PCR),

Mycobacterium bovis é membro do complexo Mycobacterium tuberculosis (MTBC), grupo este composto por espécies com grande homologia genética. É o agente etiológico da tuberculose bovina, importante zoonose transmissível ao homem, principalmente através da inalação do bacilo e/ou pelo consumo de leite e derivados não-pasteurizados provenientes de vacas tuberculosas. O objetivo deste estudo foi padronizar a identificação de micobactérias do complexo M. tuberculosis presentes no leite, por metodologia molecular. Fez-se a extração de DNA diretamente do leite contaminado e realizou-se a identificação molecular pela reação em cadeia da polimerase seguida de análise de restrição do fragmento amplificado (PRA). Utilizaram-se inhagens de referência e leite cru artificialmente contaminado com M. bovis IP. Um fragmento de 441pb do gene hsp65 foi amplificado, tratado com BstEII e HaeIII e empregou-se o perfil de restrição enzimática obtido para identificar o complexo M. tuberculosis no leite. Com a PRA foi possível detectar com especificidade e sensibilidade a presença de M. bovis em até 10 UFC/mL de leite. A metodologia padronizada poderá auxiliar os métodos microbiológicos e bioquímicos tradicionalmente usados na identificação do bacilo em alimentos suspeitos de contaminação, como, por exemplo, o leite proveniente de animais suspeitos de infecção por M. bovis.Palavras-chaves: Análise de pe