Resumo
O presente trabalho teve como objetivo verificar a influência do meio de cultivo de embriões bovinos "Beltsville Agriculture Research Center" (BARC), suplementado com SFB, BSA e PVA, separadamente, sobre a maturação de oócitos in vitro, evidenciada pela taxa de clivagem e formação de blastocistos em diferentes estágios de desenvolvimento. Três experimentos foram efetuados, de acordo com o seguinte delineamento experimental: exp.1: SFB foi adicionado ao meio BARC nas concentrações de 0, 5 e 10%; exp. 2: BSA foi adicionada ao meio BARC nas concentrações de 0, 4 e 8 mg/mL; exp. 3: PVA foi adicionado ao meio BARC nas concentrações de 0, 0,5 e 1 mg/mL. O meio de cultura TCM 199, acrescido de bicarbonato, piruvato, gentamicina, FSH, LH e SFB, foi utilizado como grupo controle. Os oócitos, obtidos de ovários de vacas destinadas ao abate comercial, foram selecionados em meio PBS e, a seguir, maturados em meio BARC acrescido de FSH, LH, gentamicina e as respectivas macromoléculas. A seleção espermática foi realizada em gradiente de Percoll, utilizando o meio TALP para a FIV. O cultivo in vitro dos embriões foi em meio SOF modificado; todas as etapas foram realizadas em incubadora a 5% de CO2 em ar, a 38,7 °C, atmosfera úmida. O número de oócitos que clivou e atingiu os estágios de blastocisto, blastocisto expandido e blastocisto eclodido foi registrado, respectivamente, as 72 e 168 horas pós-inseminação. ANOVA e teste t de Bonferroni foram empregados para a análise estatística, com P<0,05 sendo considerado significativo. Maior porcentagem (P<0,05) de oócitos que clivaram foi observada no grupo TCM + SFB do que nos grupos maturados em meio BARC com SFB ou BSA, independentemente da concentração adotada. Contudo, a taxa de fertilização foi similar entre os grupos BARC + PVA com 1 mg/mL (85,7%) e TCM + SFB (90,8%). Diferença significativa (P<0,05) foi constatada entre os grupos para o desenvolvimento de blastocistos, com o grupo TCM + SFB produzindo um maior número de blastocistos, em diferentes estágios (resultados variando de 47,4 a 51,4%) em comparação com os grupos utilizando BARC + SFB (4,1 a 19,7%), BSA (1,4 a 5,6%) e PVA (5,7 a 10,6%). Concluindo, o meio BARC suplementado com diferentes fontes de macromoléculas não foi eficiente em promover adequada maturação dos oócitos bovinos in vitro, resultando em uma baixa taxa de fertilização e de produção de blastocistos, em comparação com o meio TCM + SFB.
This study was carried out to assess the influence of bovine embryo culture medium Beltsville Agriculture Research Center (BARC), supplemented with FCS, BSA or PVA, on the in vitro oocyte maturation, evidenced by cleavage rate and blastocysts production at different developmental stages. Three experiments were performed, as follows: exp.1: addition of FCS to BARC medium at concentrations of 0, 5 and 10%; exp. 2: addition of BSA to BARC medium at concentrations of 0, 4 and 8 mg/ml; exp. 3: addition of PVA to BARC medium at concentrations of 0, 0.5 and 1.0 mg/ml. TCM 199 supplemented with bicarbonate, pyruvate, gentamicin sulfate, FSH, LH and FCS was used as control group. Oocytes obtained from cow ovaries at slaughterhouse were selected in PBS, and then matured in BARC medium supplemented with FSH, LH and gentamicin sulfate, according to the experimental design. Percoll gradient was used for sperm selection and TALP medium for IVF. In vitro embryo culture was in SOF-m medium; a humidified atmosphere with 5% CO2, in air, at 38.7°C was used for all steps. The number of oocytes reaching blastocyst, expanded blastocyst, and hatched blastocyt stages was recorded, respectively at 72 and 168 h post-insemination. ANOVA and Bonferroni t test were used to determine differences among groups. Differences of P<0.05 were taken as significant. Higher percentage (P<0.05) of cleaved oocytes was observed in group TCM + FCS than for the other groups matured in BARC supplemented with FCS or BSA, regardless the concentration used. However, the cleavage rate was similar between groups BARC plus PVA with 1 mg/ml (85.7%) and TCM + FCS (90.8%). Significant difference was found among groups for the production of blastocysts, with the control group yielding a higher number of blastocysts (results ranging from 47.4 to 51.4%, in comparison with groups using BARC + FCS (4.1 to 19.7%), BSA (1.4 to 5.6%) and PVA (5.7 to 10.6%). In conclusion, BARC medium supplemented with different macromolecules did not promote a beneficial effect on in vitro oocyte maturation, resulting in lower rate of cleavage and blastocyst production when compared with TCM + FCS medium.
El presente trabajo tuvo como objetivo verificar la influencia del medio de cultivo de embriones bovinos "Beltsville Agriculture Research Center" (BARC), complementado con SFB, BSA o PVA, en la maduración in vitro de ovocitos, evidenciado a través de la tasa de fecundación y formación de blastocistos en diferentes etapas de desarrollo. Se realizaron tres experimentos, a saber: EXP 1: SFB añadido al medio BARC en concentraciones de 0, 5 y 10%; EXP 2: BSA añadido al medio BARC en concentraciones de 0, 4 y 8 mg/ml; EXP. 3: PVA se utilizó en el medio BARC en concentraciones de 0, 0.5 y 1 mg/ml. El medio de cultivo TCM 199 con piruvato, gentamicina, FSH, LH y SFB se utilizó como grupo control. Los ovocitos, obtenidos de ovarios de vacas enviadas al matadero, se seleccionaron en medio PBS y luego fueron madurados en medio BARC con FSH, LH, gentamicina y distintas macromoléculas. La selección del esperma se hizo con gradiente de Percoll, utilizando el medio TALP para la fecundación in vitro. Los embriones fueron cultivados en medio SOF modificado; ovocitos yembriones fueron incubados a 38,7°C, 5% de CO2 en aire y atmosfera húmeda. El número de ovocitos que fertilizaron y alcanzaron los estadios de blastocisto, blastocisto expandido y blastocisto eclosionado, respectivamente, se registraron 72 y 168 horas post inseminación. Análisis de varianza y la prueba t de Bonferroni se utilizaron para el análisis estadístico, con P<0.05. Porcentaje más alto (P<0.05) de ovocitos que clivaram fue observada en el grupo TCM+ SFB que en los grupos madurados en medio BARC con SFB o BSA, independientemente de la concentración utilizada. Sin embargo, la tasa de fecundación fue similar entre grupos BARC + PVA con 1 mg/ml (85,7%) y TCM + SFB (90,8%). Diferencia significativa (P<0.05) se encontró entre los grupos para el desarrollo de blastocistos, con el grupo TCM + SFB produciendo un mayor número de blastocistos, en diferentes estadios (resultados que van desde 47,4 a 51,4%) en comparación con los grupos utilizando BARC + SFB (4,1 a 19,7%), BSA (1,4 a 5,6%) y PVA (5,7 a 10,6%). En conclusión, el medio BARC complementado con diferentes macromoléculas no fue eficiente en la promoción de una adecuada maduración de ovocitos bovinos in vitro, resultando en una tasa de fecundación y producción de blastocistos baja, en comparación con el medio TCM con SFB.
Assuntos
Animais , Bovinos , Blastocisto/fisiologia , Meios de Cultura/análise , Técnicas de Cultura Embrionária/métodos , Técnicas de Maturação in Vitro de Oócitos/métodosResumo
Melatonin (MEL) acts as a powerful scavenger of free radicals and direct gonadal responses to melatonin have been reported in the literature. Few studies, however, have evaluated the effect of MEL during in vitro maturation (IVM) on bovine embryos. This study tested the addition of MEL to maturation medium (MM) with no gonadotropins on nuclear maturation and embryo development rates and the incidence of DNA damage in resulting embryos. Cumulus-oocyte complexes were aspirated from abattoir ovaries and cultured in MM (TCM-199 medium supplemented with 10% fetal calf serum - FCS) at 39ºC and 5% CO2 in air. After 24 hours of culture in MM with 0.5 µg mL-1 FSH and 5.0 µg mL-1 LH; 10-9 M MEL) or 10-9 M MEL, 0.5 µg mL-1 FSH and 5.0 µg mL-1 LH, the oocytes were stained with Hoechst 33342 to evaluate nuclear maturation rate. After in vitro fertilization and embryo culture, development rates were evaluated and the blastocysts were assessed for DNA damage by Comet assay. There was no effect of melatonin added to the MM, alone or in combination with gonadotropins, on nuclear maturation, cleavage and blastocyst rates. These rates ranged between 88% to 90%, 85% to 88% and 42% to 46%, respectively. The extent of DNA damage in embryos was also not affected by MEL supplementation during IVM. The addition of 10-9 M MEL to the MM failed to improve nuclear maturation and embryo development rates and the incidence of DNA damage in resulting embryos, but was able to properly substitute for gonadotropins during IVM.
Melatonin (MEL) atua como um potente redutor de radicais livres. Efeito direto da MEL na função gonadal também foi observado. Existem poucos estudos relacionados ao efeito da MEL durante a maturação no desenvolvimento embrionário in vitro. Avaliou-se a adição de MEL no meio de maturação (sem gonadotrofinas) nas taxas de maturação nuclear e de desenvolvimento embrionário e na incidência de fragmentação do DNA nos embriões produzidos in vitro. Complexos cumulus-ovócitos foram aspirados de ovários provenientes de matadouros e cultivados em meio de maturação (Meio TCM-199 suplementado com 10% de soro fetal bovino) a 39ºC e 5% CO2 em ar. Após 24 horas de cultivo em meio de maturação com 0,5 µg mL-1 de FSH e 5,0 µg mL-1 de LH; 10-9 M de MEL ou 10-9 M de MEL, 0,5 µg mL-1 de FSH e 5,0 µg mL-1 de LH, os ovócitos foram corados com Hoechst 33342 para avaliação da taxa de maturação nuclear. A fragmentação do DNA dos blastocistos foi avaliada pela técnica do Cometa. Não houve efeito da MEL adicionada ao meio de maturação, com ou sem gonadotrofinas, nas taxas de maturação nuclear, clivagem e blastocistos. Os percentuais variaram entre 88% a 90%, 85% a 88% e 42% a 46%, respectivamente. O grau de fragmentação do DNA também não foi afetado pela adição de MEL ao meio de maturação. A adição de 10-9 M de MEL ao meio de maturação não exerce influência nas taxas de maturação nuclear e de desenvolvimento embrionário e nem da incidência de fragmentação do DNA dos embriões produzidos in vitro, mas pode substituir as gonadotropinas durante a maturação in vitro.
Resumo
Melatonin (MEL) acts as a powerful scavenger of free radicals and direct gonadal responses to melatonin have been reported in the literature. Few studies, however, have evaluated the effect of MEL during in vitro maturation (IVM) on bovine embryos. This study tested the addition of MEL to maturation medium (MM) with no gonadotropins on nuclear maturation and embryo development rates and the incidence of DNA damage in resulting embryos. Cumulus-oocyte complexes were aspirated from abattoir ovaries and cultured in MM (TCM-199 medium supplemented with 10% fetal calf serum - FCS) at 39ºC and 5% CO2 in air. After 24 hours of culture in MM with 0.5 µg mL-1 FSH and 5.0 µg mL-1 LH; 10-9 M MEL) or 10-9 M MEL, 0.5 µg mL-1 FSH and 5.0 µg mL-1 LH, the oocytes were stained with Hoechst 33342 to evaluate nuclear maturation rate. After in vitro fertilization and embryo culture, development rates were evaluated and the blastocysts were assessed for DNA damage by Comet assay. There was no effect of melatonin added to the MM, alone or in combination with gonadotropins, on nuclear maturation, cleavage and blastocyst rates. These rates ranged between 88% to 90%, 85% to 88% and 42% to 46%, respectively. The extent of DNA damage in embryos was also not affected by MEL supplementation during IVM. The addition of 10-9 M MEL to the MM failed to improve nuclear maturation and embryo development rates and the incidence of DNA damage in resulting embryos, but was able to properly substitute for gonadotropins during IVM.
Melatonin (MEL) atua como um potente redutor de radicais livres. Efeito direto da MEL na função gonadal também foi observado. Existem poucos estudos relacionados ao efeito da MEL durante a maturação no desenvolvimento embrionário in vitro. Avaliou-se a adição de MEL no meio de maturação (sem gonadotrofinas) nas taxas de maturação nuclear e de desenvolvimento embrionário e na incidência de fragmentação do DNA nos embriões produzidos in vitro. Complexos cumulus-ovócitos foram aspirados de ovários provenientes de matadouros e cultivados em meio de maturação (Meio TCM-199 suplementado com 10% de soro fetal bovino) a 39ºC e 5% CO2 em ar. Após 24 horas de cultivo em meio de maturação com 0,5 µg mL-1 de FSH e 5,0 µg mL-1 de LH; 10-9 M de MEL ou 10-9 M de MEL, 0,5 µg mL-1 de FSH e 5,0 µg mL-1 de LH, os ovócitos foram corados com Hoechst 33342 para avaliação da taxa de maturação nuclear. A fragmentação do DNA dos blastocistos foi avaliada pela técnica do Cometa. Não houve efeito da MEL adicionada ao meio de maturação, com ou sem gonadotrofinas, nas taxas de maturação nuclear, clivagem e blastocistos. Os percentuais variaram entre 88% a 90%, 85% a 88% e 42% a 46%, respectivamente. O grau de fragmentação do DNA também não foi afetado pela adição de MEL ao meio de maturação. A adição de 10-9 M de MEL ao meio de maturação não exerce influência nas taxas de maturação nuclear e de desenvolvimento embrionário e nem da incidência de fragmentação do DNA dos embriões produzidos in vitro, mas pode substituir as gonadotropinas durante a maturação in vitro.
Resumo
The efficacy of transferred fresh embryos was evaluated. Donors were superovulated on day 10 of the estrous cycle with 8, 7, 5 e 4 mg (48 mg) or 7, 6,4 e 3 mg (40 mg) of follicle stimulating hormonepituitary (FSH-P) twice a day, during four days. Analogue prostaglandin (cloprostenol) was injected on day 12 of the cycle and inseminations with frozen semen two or three times were performed, each 12 hours. Nonsurgical recovery of the embryos was performed with "Neustad a.d. Aisch" catheter, introducing the medium into the uterine horns with syringes. The uterine horns were flushed with modified Dulbecco"s phosphate buffered saline (PBS) enriched with 1% of foetal calf serum at 36 C. After the recovery, the embryos were morphologically evaluated under a stereomicroscope at 16x and 70x magnifications. The embryos transfers were surgically conducted through flank incision and pregnancy diagnosis made through rectal palpation on day 45-60after transfer. Two hundred twenty one embryos from Holstein cows and thirty seven from Simmental were transferred to two hundred fifty eight cross bred heifers. Pregnancy rates for fresh embryo transfer from Holstein and Simmental cows were 73.3% and 83.3%the values were not statistically different.
Este trabalho foi conduzido com o propósito de se verificar a eficácia da transferência de embriões bovinos a fresco. Para tanto, vacas doadoras foram superovuladas a partir do 10º dia do ciclo estral com FSH-P na dose de 40 ou 48 mg, via intramuscular, em duas doses diárias decrescentes, por quatro dias, seguida da administração de Cloprostenolno 12º dia do ciclo e duas a três inseminações, a intervalos de 12 horas, quando no cio. Os embriões foram recuperados através de lavagem uterina no 7º dia após o cio, sendo cada corno uterino lavado com 300 a 400 ml de Dulbecco modificado (PBS), enriquecido com1% de soro fetal bovino. Após análise morfológica sob lupa estereoscópica, os embriões foram transferidos cirurgicamente, via incisão para-lombar, para o corno uterino de receptoras previamente selecionadas. Um total de 258 embriões, sendo 221 de doadoras da raçaHolandesa e 37 da raça Simental, foram transferidos para 258 novilhas que, decorridos 45 a 60 dias da transferência, foram palpadas, por via retal, para constatação da prenhez. Foram observados, respectivamente, para embriões de vacas Holandesas e Simentais, 73,3% e 83,3% de gestações, diferença estatisticamente não significante.
Resumo
In the present report the biochemical polymorphism of Mangalarga mares hemoglobin, in reproductive age, from Santa Fé Farm, Botucatu, São Paulo, was studied. Animals were classified in two groups, according to reproductive history of each mare; the first group was performed by normal mares (control group) and the second one by animals with reproductive disorders (barren mares). From each animal, around 15 ml of vessel blood were collected. Hemoglobins were typed by polyacrylamide gel electrophoresis, 7% of concentration in the resolving gel, in a discontinuous alkaline (pH 8.6) buffer system. The following hemoglobins phenotypes were found in the control group, with the respective frequencies:A¹--- (2,0%), A¹, A²m+m+ (21,0%) e A¹A² m+m (27,0%). To the group performed by reproductive disorders carrier animals the following results were obtained : A¹--- (10,0%), A¹A² m+m+ (12,0%) e A¹A²m+m+ (28,0%). The difference observed in the A¹--- phenotype between the groups may be due to a probable liaison with hemoglobin locus and another one related with reproductive traits. Besides this fact, tropical environment effects may be acting on this locus, thus leading to obtained results
Foram estudadas as hemoglobinas de 100 éguas da raça Mangalarga, em idade de reprodução, provenientes da Fazenda Santa Fé, situada na região de Botucatu. Esses animais foram divididos em 2 grupos, de acordo com o histórico reprodutivo de cada animal, sendo um formado por éguas reprodutivamente normais e o segundo por éguas portadoras de problemas reprodutivos. Foram colhidas amostras de 15 ml de sangue com anticoagulante. As hemoglobinas foram identificadas por meio de eletroforese em gel de poliacrilamida em placa vertical, a 7% em pH 8.6, segundo Davis11 (1964). Quanto ao sistema de hemoglobinas, foram encontrados os seguintes fenótipos para o grupo de éguas reprodutivamente normais:A¹--- (2,0%), A¹, A²m+m+ (21,0%) e A¹A² m+m (27,0%); para o grupo de éguas com problemas reprodutivos: A¹--- (10,0%), A¹A² m+m+ (12,0%) e A¹A²m+m+ (28,0%). A diferença na freqüência do fenótipo A¹--- entre os grupos pode ter ocorrido devido ã existência da ligação do loco hemoglobina a outro que controlaria características de produção. Além disso, pode estar ocorrendo influência do tipo de clima existente nos trópicos.
Resumo
O presente trabalho teve como objetivo verificar a influência do meio de cultivo de embriões bovinos Beltsville Agriculture Research Center (BARC), suplementado com SFB, BSA e PVA, separadamente, sobre a maturação de oócitos in vitro, evidenciada pela taxa de clivagem e formação de blastocistos em diferentes estágios de desenvolvimento. Três experimentos foram efetuados, de acordo com o seguinte delineamento experimental: exp.1: SFB foi adicionado ao meio BARC nas concentrações de 0, 5 e 10%; exp. 2: BSA foi adicionada ao meio BARC nas concentrações de 0, 4 e 8 mg/mL; exp. 3: PVA foi adicionado ao meio BARC nas concentrações de 0, 0,5 e 1 mg/mL. O meio de cultura TCM 199, acrescido de bicarbonato, piruvato, gentamicina, FSH, LH e SFB, foi utilizado como grupo controle. Os oócitos, obtidos de ovários de vacas sacrificadas em frigorífico, foram selecionados em meio PBS e, a seguir, maturados em meio BARC acrescido de FSH, LH, gentamicina e as respectivas macromoléculas. A seleção espermática foi realizada em gradiente de Percoll, utilizando o meio TALP para a FIV. A cultura in vitro dos embriões foi em meio SOF modificado; todas as etapas foram realizadas em incubadora de CO2 a 5%, a 38,7 ºC, atmosfera úmida, em ar. O número de oócitos que clivou e atingiu os estágios de blastocisto, blastocisto expandido e blastocisto eclodido foi registrado, respectivamente, as 72 e 168 horas