Estado da arte e perspectivas da produção in vitro de embriões em caprinos / State of art and prospects of in vitro embryo production in goats

A produção in vitro de embriões (PIVE) é uma biotecnologia reprodutiva com diferentes etapas:colheita e maturação in vitro (MIV) de oócitos, fecundação in vitro (FIV) ou coincubação de espermatozoidescapacitados in vitro com oócitos maturados e cultivo in vitro (CIV) de zigotos até ao estádio de blastocisto. APIVE, em conjunto com a criopreservação de embriões, pode permitir a comercialização de embriões em largaescala, o transporte de embriões livres de patógenos e transações comerciais de germoplasma mais fáceis ebaratas. No entanto, ainda são poucas as pesquisas sobre a PIVE em caprinos em comparação com outrasespécies de produção. O objetivo desta revisão é fornecer uma visão geral do estado da arte da PIVE em caprinoscom ênfase na descrição das principais metodologias atualmente utilizadas para colheita de oócitos, MIV, FIV eCIV de embriões e apresentar as perspectivas da pesquisa nesta biotécnica.(AU)

In vitro embryo production (IVEP) is a reproductive biotechnique with a multi-step methodologycomprising: in vitro maturation (IVM) of oocytes, in vitro fertilization (IVF) or co-incubation of capacitatedspermatozoa with in vitro matured oocytes and in vitro culture (IVC) of zygotes up to the blastocyst stage. TheIVEP together with embryo cryoconservation would allow large-scale embryo marketing, a pathogen-freegenetic movement and easier and cheaper germplasm commercial transactions. There is less IVEP research ingoats compared to other farm animals. The aim of this review is to provide an overview of the state of art ofIVEP in goats with an emphasis on description of the main methodologies currently used for oocyte recovery,IVM, IVF and IVC of embryos and the future research perspectives of this biotechnique.(AU)

Estado da arte e perspectivas da produção in vitro de embriões em caprinos / State of art and prospects of in vitro embryo production in goats

A produção in vitro de embriões (PIVE) é uma biotecnologia reprodutiva com diferentes etapas:colheita e maturação in vitro (MIV) de oócitos, fecundação in vitro (FIV) ou coincubação de espermatozoidescapacitados in vitro com oócitos maturados e cultivo in vitro (CIV) de zigotos até ao estádio de blastocisto. APIVE, em conjunto com a criopreservação de embriões, pode permitir a comercialização de embriões em largaescala, o transporte de embriões livres de patógenos e transações comerciais de germoplasma mais fáceis ebaratas. No entanto, ainda são poucas as pesquisas sobre a PIVE em caprinos em comparação com outrasespécies de produção. O objetivo desta revisão é fornecer uma visão geral do estado da arte da PIVE em caprinoscom ênfase na descrição das principais metodologias atualmente utilizadas para colheita de oócitos, MIV, FIV eCIV de embriões e apresentar as perspectivas da pesquisa nesta biotécnica.

In vitro embryo production (IVEP) is a reproductive biotechnique with a multi-step methodologycomprising: in vitro maturation (IVM) of oocytes, in vitro fertilization (IVF) or co-incubation of capacitatedspermatozoa with in vitro matured oocytes and in vitro culture (IVC) of zygotes up to the blastocyst stage. TheIVEP together with embryo cryoconservation would allow large-scale embryo marketing, a pathogen-freegenetic movement and easier and cheaper germplasm commercial transactions. There is less IVEP research ingoats compared to other farm animals. The aim of this review is to provide an overview of the state of art ofIVEP in goats with an emphasis on description of the main methodologies currently used for oocyte recovery,IVM, IVF and IVC of embryos and the future research perspectives of this biotechnique.

Factors that affect oocyte vitrification in small ruminants / Fatores que afetam a vitrificação de oócitos em pequenos ruminantes

At the end of its growth, the mammalian oocyte, include in preovulatory follicle, is the largest cell of the organism, with about 120 µmin diameter. The size of oocyte, together with the specific arrangement of its organels and cytoskeleton, makes a real challenge forcryopreservation techniques. For such large cell, methods that do not require equilibrium to cryopreservation, such as vitrification,are more promising. It is important to highlight that the cryopreservation of oocytes is more difficult than zygotes or later stageembryos and this technique is a challenging task because of oocyte sensitive nature to chilling and toxic effects of cryoprotectants.However, the development of a reliable method for oocyte cryopreservation would be an important advance in the field of reproductivebiology for the preservation of genetic resources. The vitrification of mammalian oocytes is influenced by many variables, such asdifferent cryoprotectants, vitrification techniques, presence or absence of cumulus cells, the oocyte structure, metabolism (such aslevel of lipid storage) and meiotic stage. Thus, all these factors should be considered to optimize the techniques and adapt them tooocytes from each species. Therefore, the present review aims to describe the main factors that affect oocyte vitrification in sheepand goats, reporting the main findings in both species, as well as perspectives of future improvements.(AU)

No fim do seu crescimento, o oócito mamífero é a maior célula do organismo, com cerca de 120 µm de diâmetro. O tamanhodo oócito em conjunto com a disposição específica das organelas e do citoesqueleto faz com que ele represente um verdadeirodesafio para as técnicas de criopreservação. Para grandes células, métodos que não exigem equilíbrio para criopreservação,como a vitrificação, são mais promissores. É importante ressaltar que a criopreservação de oócitos é mais difícil que de zigotosou embriões em estádios mais tardios e esta técnica representa um desafio devido à natureza sensível do oócito ao resfriamentoe aos efeitos tóxicos de crioprotetores. Entretanto, o desenvolvimento de uma técnica confiável para a criopreservação oocitáriarepresentaria um avanço importante para a preservação de recursos genéticos. A vitrificação de oócitos em mamíferos é influenciadapor muitas variáveis, tais como diferentes crioprotetores, técnicas de vitrificação, presença ou ausência de células do cumulus,estrutura do oócito, metabolismo (como o nível de armazenamento de lipídios) e estágio meiótico. Assim, todos esses fatoresdevem ser considerados quando o objetivo é otimizar as técnicas e adaptá-las para oócitos de cada espécie. Assim, a presenterevisão tem como objetivo descrever os principais fatores que afetam a vitrificação de oócitos em ovinos e caprinos, relatando osprincipais resultados em ambas as espécies, bem como as perspectivas de melhorias futuras.(AU)

Laparoscopic ovum pick up (LOPU) in goats: from hormonal treatment to oocyte possible destinations / Colheita de oócitos por laparoscopia em caprinos: do tratamento hormonal aos possíveis destinos dos oócitos

Whether we are collecting oocytes from donors as part of a program of in vitro embryo production (IVP) and/or to promote advances in emerging biotechnologies as cloning and transgenesis, the success rate depends on the development of methodological aspects of recovering oocytes. To succeed, sufficient number of good quality oocytes is the prerequisite for various reproductive techniques and laparoscopic ovum pick up (LOPU) is the recommended technique for obtaining them from live goats. However, the variability of the quantity and quality of the oocytes collected still limits the large-scale use of this technology. Under the current conditions, too large variability is reported with oocyte recovery rates ranging from 40 to 90%, and the number of harvested oocytes per female between 4 and 14, in different laboratories. This variability can depend on either intrinsic characteristic of the donors, suchas breed, age, individual response or on aspects that we might be able to control, such as stimulation treatment, type of needle, aspiration pressure, among others. We believe that new investigations should contribute to significant improvement of LOPU yield. This review aims to report different factors influencing goat donor response for LOPU, presenting main steps for oocytes recovery as well as technical alternatives for improving LOPU efficiency. Furthermore, it is aimed to discuss about the potential use of goatoocytes after their recovery by LOPU and present overall results in goat IVP worldwide.(AU)

Independentemente se a coleta de oócitos é parte de um programa de produção in vitro de embriões (PIVE) e/ou promoverá avanços biotecnológicos como clonagem e transgênese, os aspectos metodológicos nas técnicas de recuperação de oócitos são imprescindíveis. Para alcançar sucesso de forma ótima, número suficiente de oócitos de boa qualidade é pré-requisito para diversas técnicas reprodutivas e a colheita de oócitos por laparoscopia (COL) é a técnica recomendada para obtê-los de cabras saudáveis. Entretanto, a variabilidade na quantidade e qualidade de oócitos coletados ainda limita o uso desta tecnologia em grande escala. Sob as condições atuais, uma grande variação é relatada na literatura com taxas de recuperação de oócitos variando de 40 a 90% e o número de estruturas coletadas por fêmea entre 4 e 14 oócitos em diferentes laboratórios. Esta variabilidade pode ocorrer tanto em função de variáveis não controláveis, como raça, idade e características intrínsecas da cabra, como devido a aspectos controláveis, como o tratamento superestimulatório, tipo da agulha, pressão de aspiração, dentre outros. Acredita-se que novas pesquisas devam contribuir significativamente para a melhoria da técnica de COL. Esta revisão objetiva relatar os diferentes fatores que influenciam a resposta de cabras doadoras após COL, apresentando as principais etapas para recuperação oocitária assim como modificações técnicas propostas para melhoria da eficiência da COL. Além disso, discutir sobre potencias aplicações de oócitos caprinos depois de sua recuperação por COL e resultados gerais sobre a técnica no mundo.(AU)

Laparoscopic ovum pick up (LOPU) in goats: from hormonal treatment to oocyte possible destinations / Colheita de oócitos por laparoscopia em caprinos: do tratamento hormonal aos possíveis destinos dos oócitos

Whether we are collecting oocytes from donors as part of a program of in vitro embryo production (IVP) and/or to promote advances in emerging biotechnologies as cloning and transgenesis, the success rate depends on the development of methodological aspects of recovering oocytes. To succeed, sufficient number of good quality oocytes is the prerequisite for various reproductive techniques and laparoscopic ovum pick up (LOPU) is the recommended technique for obtaining them from live goats. However, the variability of the quantity and quality of the oocytes collected still limits the large-scale use of this technology. Under the current conditions, too large variability is reported with oocyte recovery rates ranging from 40 to 90%, and the number of harvested oocytes per female between 4 and 14, in different laboratories. This variability can depend on either intrinsic characteristic of the donors, suchas breed, age, individual response or on aspects that we might be able to control, such as stimulation treatment, type of needle, aspiration pressure, among others. We believe that new investigations should contribute to significant improvement of LOPU yield. This review aims to report different factors influencing goat donor response for LOPU, presenting main steps for oocytes recovery as well as technical alternatives for improving LOPU efficiency. Furthermore, it is aimed to discuss about the potential use of goatoocytes after their recovery by LOPU and present overall results in goat IVP worldwide.

Independentemente se a coleta de oócitos é parte de um programa de produção in vitro de embriões (PIVE) e/ou promoverá avanços biotecnológicos como clonagem e transgênese, os aspectos metodológicos nas técnicas de recuperação de oócitos são imprescindíveis. Para alcançar sucesso de forma ótima, número suficiente de oócitos de boa qualidade é pré-requisito para diversas técnicas reprodutivas e a colheita de oócitos por laparoscopia (COL) é a técnica recomendada para obtê-los de cabras saudáveis. Entretanto, a variabilidade na quantidade e qualidade de oócitos coletados ainda limita o uso desta tecnologia em grande escala. Sob as condições atuais, uma grande variação é relatada na literatura com taxas de recuperação de oócitos variando de 40 a 90% e o número de estruturas coletadas por fêmea entre 4 e 14 oócitos em diferentes laboratórios. Esta variabilidade pode ocorrer tanto em função de variáveis não controláveis, como raça, idade e características intrínsecas da cabra, como devido a aspectos controláveis, como o tratamento superestimulatório, tipo da agulha, pressão de aspiração, dentre outros. Acredita-se que novas pesquisas devam contribuir significativamente para a melhoria da técnica de COL. Esta revisão objetiva relatar os diferentes fatores que influenciam a resposta de cabras doadoras após COL, apresentando as principais etapas para recuperação oocitária assim como modificações técnicas propostas para melhoria da eficiência da COL. Além disso, discutir sobre potencias aplicações de oócitos caprinos depois de sua recuperação por COL e resultados gerais sobre a técnica no mundo.

Factors that affect oocyte vitrification in small ruminants / Fatores que afetam a vitrificação de oócitos em pequenos ruminantes

At the end of its growth, the mammalian oocyte, include in preovulatory follicle, is the largest cell of the organism, with about 120 µmin diameter. The size of oocyte, together with the specific arrangement of its organels and cytoskeleton, makes a real challenge forcryopreservation techniques. For such large cell, methods that do not require equilibrium to cryopreservation, such as vitrification,are more promising. It is important to highlight that the cryopreservation of oocytes is more difficult than zygotes or later stageembryos and this technique is a challenging task because of oocyte sensitive nature to chilling and toxic effects of cryoprotectants.However, the development of a reliable method for oocyte cryopreservation would be an important advance in the field of reproductivebiology for the preservation of genetic resources. The vitrification of mammalian oocytes is influenced by many variables, such asdifferent cryoprotectants, vitrification techniques, presence or absence of cumulus cells, the oocyte structure, metabolism (such aslevel of lipid storage) and meiotic stage. Thus, all these factors should be considered to optimize the techniques and adapt them tooocytes from each species. Therefore, the present review aims to describe the main factors that affect oocyte vitrification in sheepand goats, reporting the main findings in both species, as well as perspectives of future improvements.

No fim do seu crescimento, o oócito mamífero é a maior célula do organismo, com cerca de 120 µm de diâmetro. O tamanhodo oócito em conjunto com a disposição específica das organelas e do citoesqueleto faz com que ele represente um verdadeirodesafio para as técnicas de criopreservação. Para grandes células, métodos que não exigem equilíbrio para criopreservação,como a vitrificação, são mais promissores. É importante ressaltar que a criopreservação de oócitos é mais difícil que de zigotosou embriões em estádios mais tardios e esta técnica representa um desafio devido à natureza sensível do oócito ao resfriamentoe aos efeitos tóxicos de crioprotetores. Entretanto, o desenvolvimento de uma técnica confiável para a criopreservação oocitáriarepresentaria um avanço importante para a preservação de recursos genéticos. A vitrificação de oócitos em mamíferos é influenciadapor muitas variáveis, tais como diferentes crioprotetores, técnicas de vitrificação, presença ou ausência de células do cumulus,estrutura do oócito, metabolismo (como o nível de armazenamento de lipídios) e estágio meiótico. Assim, todos esses fatoresdevem ser considerados quando o objetivo é otimizar as técnicas e adaptá-las para oócitos de cada espécie. Assim, a presenterevisão tem como objetivo descrever os principais fatores que afetam a vitrificação de oócitos em ovinos e caprinos, relatando osprincipais resultados em ambas as espécies, bem como as perspectivas de melhorias futuras.

Early development of ruminant embryos, autonomous process or the result of a positive dialog with surrounding maternal tissues?

Background: After artificial insemination and multiple ovulation and embryo transfer (MOET), in vitro production of embryos (IVP) represents the third generation of techniques aimed at a better control of animal reproduction. This technique involves four major steps: oocyte collection, oocyte in vitro maturation (IVM), in vitro fertilization (IVF) and in vitro development of the resulting embryos (IVD). These different steps are now well established in domestic ruminant species (cattle, sheep and goat) although the variability of the number and quality of the oocytes collected and the low viability of frozen ­ thawed in vitro produced embryos still limit the large-scale use of this promising technology. Beyond the potential use of IVP in breeding schemes, this technique is also required for the establishment of new biotechnologies such as cloning and transgenesis. Additionally, the knowledge of oocyte and embryo physiology acquired through IVP techniques may stimulate the further development of other techniques such as marker assisted and genomic selection of preimplantation embryos and also benefit to assisted procreation in human being. This paper will discuss the possible function of maternal environment in the regulation of early development and the consequences of these functions for IVP, in view to improve IVP embryos viability. Review: Comparisons between in vivo and in vitro produced embryos pointed out several differences in morphology, metabolism and gene expression. IVP embryos have a modified lipid metabolism, resulting in increased triglycerids accumulation, translating into different density. This altered lipid metabolism may account for differences in membrane structure and increased sensitivity to oxidative stress, resulting in lower cryoresistance of these IVP embryos. The identification of modified metabolic pathways leading to these lipidic disorders will provide clues for modification of culture conditions in view to restore normal lipid metabolism through appropriate precursors supplementation of the media. The natural embryo environment from fertilization to blastocyst stage is the oviduct. In vivo, oviduct epithelial cells provide ideal development support by regulating physico-chemical embryo microenvironment. Under in vitro conditions, the lack oviduct support may result in embryo exposure to toxic metabolites and oxidative stress. In addition, in vitro developing embryos may lack oviduct originated embryotrophic factors that regulate and stimulate early development in vivo. The use of co culture systems to mimic natural embryo environment in vitro may allow to improve embryo development, restore normal metabolic parameters, and increase embryo viability and cryoresistance. In addition, such co culture systems involving oviduct epithelial cells will help to identify critical development parameters and to point out potential embryotrophic factors. Conclusion: In vitro embryo production is a promising technique for improvement of selection schemes and diffusion of genetic gain through safe exchanges of embryos. To allow a lager use of this technology, improvements should be obtained in management of oocyte collection and in vitro treatment to improve its quality and in embryo in vitro development systems. A better knowledge of interactions between the developing embryo and maternal environment will allow to improve in vitro systems to produce high viability embryos.