Resumo
XAVIER, P.L.P. Explorando Mecanismos Epigenéticos Contra Células de Câncer de Mama: Uma Abordagem Comparada. 185F. Tese (Doutorado). Faculdade de Zootecnia e Engenharia de Alimentos. Universidade de São Paulo. O câncer é uma das principais causas de morte em cães no mundo e as neoplasias mamárias representam mais de 50% dos tumores diagnosticados em fêmeas. Além disso, as neoplasias mamárias apresentam uma série de similaridades clínicas e moleculares com o câncer de mama em mulheres, destacando-as como excelentes modelos para o estudo da oncologia comparada. Os mecanismos epigenéticos são responsáveis por regular a expressão gênica nas células e desregulações nesses mecanismos estão associadas ao desenvolvimento de diversos tipos de câncer tanto em humanos como em cães. Assim, a utilização do modelo canino pode ser importante para o desenvolvimento de potenciais terapias epigenéticas para o câncer, em específico para o câncer de mama. Assim, essa tese teve como principais objetivos: 1) revisar os mecanismos epigenéticos que estão por trás do desenvolvimento de diferentes tipos de câncer em cães, comparandoos com as anormalidades já bem descritas no câncer humano; 2) determinar possíveis alvos moleculares associados aos processos de tumorigenicidade e invasão de células de câncer de mama canino (Células CMC); 3) determinar potenciais alvos epigenéticos associados ao potencial de tumorigenicidade e auto-renovação de células de câncer de mama canino; 4) observar os efeitos de um novo inibidor duplo de proteínas epigenéticas BET e deacetilases de histonas (HDACs) em células de câncer de mama humano utilizando modelos in vitro 2D e 3D. No primeiro capítulo, reunimos uma série de informações demonstrando que algumas modificações epigenéticas são similares no câncer em humanos e caninos, sugerindo uma potencial abordagem utilizando o modelo canino para determinar novos mecanismos epigenéticos reguladores do câncer e para o desenvolvimento de novas terapias. No capítulo 2, utilizando modelos in vitro, demonstramos que os fatores de transcrição associados ao processo de transição epitéliomesenquimal (EMT), ZEB1 e ZEB2, estão associados ao potencial de tumorigenicidade e invasão de células CMC e são mais expressos em células CMC com fenótipo mesenquimal do que células CMC com fenótipo epitelial. Além disso, observamos que vias moleculares associadas aos processos de EMT, invasão e tumorigenicidade, como organização e degradação de matriz extracelular, adesão focal, sinalização de TGF/BMP, PI3K-AKT e WNT são enriquecidas em genes superexpressos nas células CMC com fenótipo mesenquimal. Além disso, esse trabalho foi importante para a determinação das linhagens com maior potencial tumorigênico no nosso banco de células para a utilização no capítulo 3. Já no capítulo 3, nós demonstramos que a inibição de uma família de proteínas readers epigenéticas, conhecidas como proteínas BET, pelo inibidor (+)- JQ1, é uma estratégia promissora para inibir os fenótipos de tumorigenicidade e autorenovação de células CMC, em modelos in vitro. A inibição das proteínas BET resultou em diminuição da formação de tumoresferas em placas de baixa aderência e de colônias no ensaio de ágar-mole, dois modelos in vitro utilizados para se estudar auto-renovação e tumorigenicidade. Além disso, inibição de proteínas BET resultou em diminuição da expressão de importantes genes associados a vias moleculares de auto-renovação como WNT, NOTCH, Hedgehog e PI3K/AKT/mTOR, e supressou a expressão de ZEB2, o qual demonstramos ser importante para o fenótipo de tumorigenicidade em células CMC no capítulo 2. Finalmente, no capítulo 4 determinamos que o inibidor duplo de proteínas BET/HDACs, TW09, reduziu a viabilidade celular e aumentou a morte celular em células de câncer de mama humano em comparação com as inibições individuais de proteínas BET e HDACs. Além disso, TW09 diminuiu a formação de tumoresferas primárias e secundárias demonstrando efeito sobre os potenciais de tumorigenicidade e autorenovação das células de câncer de mama. Sendo assim, TW09 demonstrou bons efeitos nessas células. Ainda pretendemos aprofundar ainda mais os estudos dos efeitos da inibição dupla de proteínas BET/HDACs por TW09 no câncer de mama, em células humanas e caninas, podendo confirmar essa estratégia como uma potencial terapia para o câncer de mama em ambas espécies. Por fim, os resultados demonstrados ao longo dos capítulos dessa tese colaboram para a confirmação e descoberta de mecanismos importantes para o desenvolvimento do câncer de mama em cães e seus fenótipos, além de ressaltarem o modelo canino como um bom modelo para o estudo da oncologia comparada e busca de novos alvos e terapias contra o câncer, já que vários dos mecanismos e efeitos observados nesse modelo, corroboram com aqueles vistos em células de câncer humano.
XAVIER, P.L.P. Exploring Epigenetic Mechanisms to Target Mammary Cancer Cells: A Comparative Approach. 185p. PhD Thesis. Faculty of Animal Science and Food Engineering. University of São Paulo. 2020. Cancer is one of the main causes of deaths in dogs worldwide, and mammary cancer in female dogs corresponding to more than 50% of all types of tumors. In addition, mammary tumors in dogs share many clinical and molecular similarities in comparison to breast cancer in women. Therefore, dogs are great models for comparative studies in oncology. Epigenetic mechanisms are key regulators of gene expression and dysregulation of these mechanisms are associated to the development of several types of cancer both in humans and dogs. Thus, canine model may be important for the development of innovative and potential therapies for cancer, especially for breast cancer. Thus, the main purposes of this thesis were: 1) to review the epigenetic mechanisms behind the development of different types of cancer in dogs, in comparison with abnormalities well described in human cancer; 2) to determine possible molecular targets associated with tumorigenicity and invasiveness in canine mammary cancer cells (CMC cells); 3) to determine potential epigenetic targets associated with self-renewal and tumorigenicity in CMC cells; 4) to observe the effects of a new dual BET/HDAC inhibitor in human breast cancer cells using 2D and 3D in vitro models. In the first chapter, we gathered findings demonstrating that some epigenetic abnormalities are similar in both human and canine cancer, suggesting a potential approach to use the canine model to determine new epigenetic mechanisms regulating cancer and to develop new therapies. In chapter 2, using in vitro models, we demonstrate that epithelial-mesenchymal (EMT)- associated transcription factors, ZEB1 and ZEB2, are associated with tumorigenicity and invasiveness of CMC cells, exhibiting higher expression in mesenchymal-like cells in comparison with epithelial-like cells. In addition, we observed that molecular pathways associated with EMT, invasiveness, and tumorigenicity, such as ECM organization and degradation, focal adhesion, TGF- / BMP signaling, PI3K-AKT signaling, and WNT signaling are enriched to upregulated genes overexpressed in mesenchymal-like cells. Furthermore, this work was important to determine cell lines presenting higher tumorigenic potential in our cell bank. In chapter 3, we demonstrated that inhibition of a family of epigenetic reader proteins, known as BET proteins, by (+)-JQ1, is a promising strategy to suppress in vitro tumorigenicity and self-renewal of CMC cells. BET inhibition resulted in a decrease of tumorspheres formation in low-adherence plates and colony formation in soft-agar assay, classical models used to assess in vitro self-renewal and tumorigenicity. Furthermore, inhibition of BET proteins decreased expression of important genes associated with self-renewal pathways including WNT, NOTCH, Hedgehog and PI3K/AKT/mTOR. Besides that, BET inhibition decreased ZEB2 expression, a transcription factor important for the maintenance of self-renewal in CMC cells. Finally, in chapter 4, we observed that the dual BET/HDAC inhibitor, TW09, reduced cell viability and increased cell death in human breast cancer cells in comparison with individual inhibition of BET and HDAC proteins by (+)-JQ1 and CI994, respectively. In addition, TW09 reduced number of primary and secondary BC tumorspheres, suggesting effects regarding tumorigenicity and self-renewal potential of breast cancer cells. Thus, TW09 demonstrated good effects in these cells. We still intend to deeply study the effects of dual BET/HDAC inhibition by TW09 on breast cancer both in human and canine cells in order to confirm this strategy as a potential and innovative therapy for mammary cancer in both species. Finally, the results demonstrated in this thesis collaborate to the validation and discovery of important mechanisms behind mammary cancer and its phenotypes in dogs, besides highlight the canine model as a great model to perform comparative studies in oncology and search for new targets and therapies for cancer, since several of the mechanisms and effects observed in this model, corroborate those observed in human cancer cells.
Resumo
As neoplasias mamárias apresentam um grande desafio tanto para a medicina humana, quanto para a medicina veterinária. Esses tumores apresentam ampla heterogeneidade intertumoral e intratumoral, dificultando assim a busca por tratamentos eficazes. Recentemente, pesquisadores tem voltado sua atenção para uma população de células que apresentam características muito semelhantes as células-tronco. São as chamadas células iniciadoras de tumores (CITs). Estas são descritas como as principais responsáveis por falhas nas quimioterapias e no surgimento de recidivas tumorais, devido ao seu potencial tumorigênico, de auto-renovação e de resistência a drogas antineoplásicas. Entretanto, o estudo dessas células é limitado pelas dificuldades no isolamento e na caracterização pós-enriquecimento dessas células, devido à perda do fenótipo em modelos in vitro. Sendo assim, vários estudos estão buscando maneiras alternativas de enriquecer essa população. Uma das maneiras mais utilizadas, baseia-se na indução do processo de transição epitélio-mesenquimal, através da superexpressão de fatores de transcrição como SNAI1, SLUG, ZEB1 e ZEB2. Sendo assim, nós objetivamos expressar de maneira exógena os fatores de transcrição SLUG e ZEB1 em células oriundas de carcinomas mamários caninos, caracterizar seus efeitos nessas células e observar se esses fatores de transcrição seriam capazes de induzir o fenótipo de CIT. Primeiramente, quatro amostras de carcinomas mamários caninos foram analisados quanto sua morfologia e os níveis de expressão gênica de quatro fatores de transcrição associados a transição epitélio-mesenquimal: SLUG, STAT3, ZEB1 e ZEB2. Após, nós selecionamos duas dessas amostras (CC-20E e CL-28E), que apresentavam morfologia típica de células epiteliais e baixa expressão dos fatores de transcrição citados acima e expressamos de maneira exógena e de forma estável os fatores de transcrição SLUG e ZEB1, através do processo de transdução lentiviral. Entretanto, apenas a transdução com os plasmídeos contendo a região codificante de SLUG foi eficiente. Sendo assim, nós avaliamos os efeitos da expressão exógena de SLUG nas células CC-20E e CL-28E, quanto a alteração de morfologia e expressão de filamentos intermediários como citoqueratina, vimentina e actina. Além disso, nós avaliamos se a expressão exógena de SLUG poderia regular a expressão de outros genes associados a EMT, além de genes supressores de tumores, alvos de SLUG. Por fim, nós avaliamos se a expressão exógena de SLUG poderia induzir ao fenótipo de CITs, verificando se havia alteração na sensibilidade das células aos quimioterápicos doxorrubicina e paclitaxel, além de avaliar o potencial tumorigênico e de auto-renovação dessas células em cultivos de baixa aderência. A expressão exógena de SLUG nas células CC-20E e CL-28E, não induziu a alterações na morfologia epitelial das células. Entretanto, as células alteraram sua disposição em monocamada no cultivo, formando tipos de túbulos semidiferenciados, característicos do processo de EMT híbrido ou parcial. Além, disso, houve um equilíbrio entre a expressão dos filamentos intermediários de citoqueratina e vimentina nas células, além do aumento na expressão dos genes CDH1 (E-caderina) e CDH2 (N-caderina), resultado que sustentou a indução de EMT parcial. O processo de EMT parcial induziu maior resistência ao quimioterápico paclitaxel, além de potencializar a tumorigenecidade e a capacidade de auto-renovação das células em cultivos de baixa aderência. Sendo assim, no presente estudo, nós obtivemos um cultivo com características que mimetizam as CITs, demonstrando que os processos que induzem esse fenótipo são semelhantes tanto na espécie canina, quanto em humanos, sustentando a hipótese de que neoplasias mamárias caninas podem servir como modelo para o estudo das CITs e, consequentemente, do desenvolvimento neoplásico de tumores sólidos.
Mammary neoplasms present a major challenge for both human and veterinary medicine, due to intertumoral and intratumoral heterogeneity, hindering the search for effective treatments. Recently, researchers has highlighted a population of cells with features very similar to stem cells. Known as Tumor-Initiating Cells (TICs), they are described as the main responsible for chemotherapy failures and tumor recurrence, due to their tumorigenic potential, self-renewal ability and drug resistance. The study of TICs is limited mainly by their difficult isolation owing to specific markers absence, and furthermore, cells lose their phenotype when placed in vitro. Therefore, several studies are seeking for alternatives to enrich this population in regular cultures. One way is based on the epithelial-mesenchymal transition induction through of transcription factors overexpression, such as SNAI1, SLUG, ZEB1 e ZEB2. So, the aim of this study was to overexpresse the SLUG and ZEB1 transcription factors in a cell culture derived from canine mammary carcinomas, evaluate its effects and observe whether these transcription factors would be capable of inducing the TIC phenotype. First, four canine mammary carcinomas cell cultures were analyzed for their morphology and gene expression levels of four transcription factors associated with epithelial-mesenchymal transition: SLUG, STAT3, and ZEB1 ZEB2. After, we selected two samples (CC-20E and CL-28E) with typical morphology of epithelial cells and low expression of the transcription factors mentioned above. We then overexpress, stably, the transcription factors SLUG and ZEB1 by lentiviral transduction, However, only SLUG transduction was efficient. Then, we evaluated the effects of SLUG overexpression in CC-20E and CL-28E cells as the change of morphology, expression of intermediate filaments as cytokeratin, vimentin and actin. In addition, we evaluated whether SLUG overexpression could regulate the expression of other EMT-associated genes as well as tumor suppressor genes, and assessed evaluated the tumorigenic potential and self-renewal of these cells in low adherence cultures. Finally, we assessed whether SLUG overexpression could induce drug resistance through doxorubicin and paclitaxel sensivity assay. The SLUG overexpression did not induce modification in epithelial cell morphology, however, cells changed their arrangement in monolayer culture, inducing the semidifferentiated tubules, typical of hybrid or partial EMT process. In, addition, there was a balanced expression between cytokeratin and vimentin, possibly explained by an increase in CDH1 expression (E-cadherin) and CDH2 (N-cadherin) typical of partial EMT. Furthermore, the partial EMT generated cells presenting paclitaxel resistance, and enhanced the tumorigenic potential and self-renewal capacity of the cells on low adherent plates. Thus, in this study, we obtained a cell culture exhibiting features that mimics the TICs, demonstrating the mechanisms which regulate this phenotype are similar in dogs and humans, supporting the hypothesis that canine mammary carcinomas are a great model for the study of TICs and solid tumors development.