Use of ELISA based on NcSRS2 of Neospora caninum expressed in Pichia pastoris for diagnosing neosporosis in sheep and dogs / Utilização de um ELISA baseado em NcSRS2 de Neospora caninum expressa em Pichia pastoris para diagnóstico de neosporose em ovinos e cães

Neosporosis is a disease caused by the protozoon Neospora caninum that leads to significant economic losses in many countries. In the present study, we report on use of the recombinant protein NcSRS2 of N. caninum expressed in Pichia pastoris in an indirect immunoenzymatic assay (ELISA) for diagnosing neosporosis infection in sheep and dogs. We observed that the ELISA test yielded specificity of 94.5% and sensitivity of 100% for sheep and specificity of 93.3% and sensitivity of 100% for dogs. We observed that the sensitivity was higher than shown by the indirect fluorescent antibody test, and this was confirmed by means of Western blot. The results from this study suggest that the recombinant protein expressed in P. pastoris is a suitable antigen for use in immunodiagnosis to detect N. caninum in two important species exposed to this parasitosis.(AU)

A neosporose é uma doença causada pelo protozoário Neospora caninum que leva a perdas econômicas importantes em muitos países. No presente estudo, é descrita a utilização da proteína recombinante NcSRS2 de N. caninum expressa em Pichia pastoris em um ensaio imunoenzimático indireto (ELISA) para o diagnóstico de infecção por Neospora em ovelhas e cães. Observou-se, que utilizando-se um ELISA, o teste produziu uma especificidade de 94,5% e uma sensibilidade de 100% para ovinos, e uma especificidade de 93,3% e sensibilidade de 100% para cães. Uma maior sensibilidade foi observada em relação à IFI que foi confirmada por Western blot. Os resultados deste estudo sugerem que a proteína recombinante expressa em P. pastoris é bom antígeno para ser utilizado no diagnóstico imunológico para detectar N. caninum em duas espécies importantes expostas a esta parasitose.(AU)

Expressão heteróloga da EMA-2 (equi merozoite antigen) de Theileria equi em Pichia pastoris com potencial utilização em imunobiológicos / Heterologous expression of EMA-2 (equi merozoite antigen) of Theileria equi in Pichia pastoris with potential use in immunobiologics

A piroplasmose equina causada por Theileria equi acomete os equinos de forma endêmica no Brasil e em diversos outros países tropicais e subtropicais. Considerada uma das mais importantes doenças de equinos, causa danos à saúde animal e perdas econômicas. A proteína equi merozoite antigen (EMA-2) é uma das principais proteínas de superfície, expressa nos diversos estágios do ciclo do parasita, estimula resposta imune em animais infectados, tornando-se um possível candidato para utilização em diagnóstico. O gene EMA-2 foi clonado e expresso na levedura Pichia pastoris. A proteína EMA-2 recombinante (rEMA-2) foi caracterizada antigenicamente por Western Blot e por ELISA indireto, utilizando-se soro de equino positivo para theileriose. O resultado do ELISA demonstrou uma especificidade de 90,9% e sensibilidade de 83,3%, quando comparado ao padrão, sendo superior à imunofluorescência (80,6% de especificidade e 75,0% de sensibilidade), o que sugere que a rEMA-2 expressa em P. pastoris é um promissor antígeno para ser utilizado como ferramenta no imunodiagnóstico de theileriose equina.(AU)

Theileria equi, the causative agent of equine piroplasmosis, is endemic in Brazil and many other tropical and subtropical countries. It is considered one of the most important diseases of horses causing animal health problems and significant economic loss. The Protein equi merozoite antigen-2 (EMA-2) is a major surface protein that is expressed in different parasite cycle stages and induces immune response in infected animals, being a possible candidate to be used in diagnose. EMA-2 gene was cloned and expressed in the yeast Pichia pastoris, and the recombinant protein EMA-2 (rEMA-2) was characterized by Western Blot and indirect ELISA using equine positive sera. The ELISA results demonstrated a specificity of 90.9% and a sensitivity of 83.3% compared to the standard ELISA and being superior to immunofluorescence (80.6% of specificity and 75.0% of sensitivity) suggesting that the rEMA-2 expressed in P. pastoris is a promising antigen to be used as a tool in immunodiagnostic of theileriasis.(AU)

Bovine immunoprotection against Rhipicephalus (Boophilus) microplus with recombinant Bm86-Campo Grande antigen / Imunoproteção de bovinos contra Rhipicephalus (Boophilus) microplus com antígeno recombinante Bm86-Campo Grande

The southern cattle fever tick, Rhipicephalus (Boophilus) microplus, is no doubt the most economically important ectoparasite of cattle globally. The inappropriate use of chemical acaricides has driven the evolution of resistance in populations of R. (B.) microplus. Anti-tick vaccines represent a technology that can be combined with acaricides in integrated control programs to mitigate the impact of R. (B.) microplus. The recombinant form of Bm86 antigen from the Campo Grande (rBm86-CG) strain of R. (B.) microplus was produced using the Pichiapastoris expression system to test its ability to immunoprotect cattle against tick infestation. Secretion of rBm86-CG by P. pastoris through the bioprocess reported here simplified purification of the antigen. A specific humoral immune response was detected by ELISA in vaccinated cattle. Immunoblot results revealed that polyclonal antibodies from vaccinated cattle recognized a protein in larval extracts with a molecular weight corresponding to Bm86. The rBm86-CG antigen showed 31% efficacy against the Campo Grande strain of R. (B.) microplus infesting vaccinated cattle. The rBm86-CG is an antigen that could be used in a polyvalent vaccine as part of an integrated program for the control of R. (B.) microplus in the region that includes Mato Grosso do Sul.(AU)

O carrapato Rhipicephalus (Boophilus) microplus é, sem dúvidas, o ectoparasito economicamente mais importante para o gado a nível mundial. A utilização inadequada de acaricidas tem impulsionado a evolução da resistência em populações de R. (B.) microplus. Vacinas contra o carrapato representam uma tecnologia que pode ser combinada com acaricidas em programas de controle integrado para diminuir o impacto de R. (B.) microplus. A forma recombinante da Bm86 da cepa Campo Grande (rBm86-CG) de R. (B.) microplus foi produzido utilizando o sistema de expressão em Pichia pastoris para testar sua capacidade de imunoproteção ao gado contra a infestação de carrapatos. A secreção de rBm86-CG em P. pastoris pelo bioprocesso, simplificou a purificação do antígeno. A resposta imune humoral específica foi detectada por ELISA em soros de bovinos vacinados. Resultados de "imunoblot" revelaram que anticorpos policlonais de bovinos vacinados reconheceram uma proteína em extratos de larvas com um peso molecular correspondente à Bm86. O antígeno rBm86-CG mostrou eficácia de 31% contra a amostra CG de R. (B.) microplus utilizada para infestar os bovinos vacinados. Pelos resultados obtidos, concluímos que a rBm86-CG é um antígeno que pode ser usado em uma vacina polivalente, como parte de um programa integrado para o controle de R. (B.) microplus no estado do Mato Grosso do Sul, Brasil.(AU)

Genetic paternity test for piglets generated by heterospermic cervical and post-cervical artificial insemination / Determinação genética da paternidade em leitões nascidos de inseminação artificial heterospérmica cervical e pós-cervical

Post-cervical artificial insemination (AI) with reduced sperm concentration allows the use of semen from few boars on a high number of females, but the common use of pooled semen in commercial AI programs masks the subfertility of individual boars. This study compared the reproductive performance of post-cervical and cervical heterospermic AI, in commercial farm conditions and through paternity tests. Each AI method was conducted in two groups of 150 sows. Sperm concentration was 3.0 x 109/85mL for cervical AI and 1.5 x 109/60mL for post-cervical AI. Conception and farrowing rates for post-cervical AI (90.7% and 85.3%, respectively) were lower (P<0.05) than for cervical AI (98.7% and 94.7%, respectively). Total litter size did not differ (P>0.05) for post-cervical (12.8 ± 0.3) and cervical AI (13.5 ± 0.3), but it was greater (P<0.05) for parity-two females than for those having 3-5 parities. The paternity test used nine microsatellite markers to genotype 300 piglets from 25 litters, but paternity exclusion was achieved for only 95 piglets, which did not differentiate boars across AI methods.

A inseminação artificial intra-uterina (IAIC) com reduzida concentração de espermatozóides por dose permite que o sêmen de um menor número de reprodutores seja usado em um maior número de fêmeas. Porém, o uso freqüente de pools de sêmen de dois ou mais machos na inseminação heterospérmica pode mascarar o baixo desempenho de alguns reprodutores. O objetivo deste estudo foi comparar o desempenho reprodutivo da IAIU com a inseminação artificial intracervical (IAIC), usando amostras heterospérmicas de sêmen, em condições de rotina de campo e através de teste de paternidade. A IAIC foi feita com 3,0 x 109espermatozóides/85mL e a IAIU foi feita com 1,5 x 109 espermatozóides/60mL, ambas em grupos de 150 fêmeas. A IAIU apresentou taxas menores (P<0,05) de concepção (90,7%) e parição (85,3%) do que a IAIC (98,7% e 94,7%, respectivamente). O tamanho total da leitegada não diferiu (P>0,05) entre IAIC (13,7 ± 0,3) e IAIU (13,0 ± 0,3), mas foi mais alto nas fêmeas de segundo parto do que nas com 3-5 partos (P<0,05). O teste de paternidade usou nove microssatélites para a genotipagem de 25 leitegadas, totalizando 300 leitões, havendo exclusão de paternidade somente em 95 leitões, o que não permitiu diferenciação entre os machos, dentro das técnicas de IA.

Genetic paternity test for piglets generated by heterospermic cervical and post-cervical artificial insemination / Determinação genética da paternidade em leitões nascidos de inseminação artificial heterospérmica cervical e pós-cervical

Post-cervical artificial insemination (AI) with reduced sperm concentration allows the use of semen from few boars on a high number of females, but the common use of pooled semen in commercial AI programs masks the subfertility of individual boars. This study compared the reproductive performance of postcervical and cervical heterospermic AI, in commercial farm conditions and through paternity tests. Each AI method was conducted in two groups of 150 sows. Sperm concentration was 3.0 x 109/85mL for cervical AI and 1.5 x 109/60mL for post-cervical AI. Conception and farrowing rates for post-cervical AI (90.7% and 85.3%, respectively) were lower (P<0.05) than for cervical AI (98.7% and 94.7%, respectively). Total litter size did not differ (P>0.05) for post-cervical (12.8 ± 0.3) and cervical AI (13.5 ± 0.3), but it was greater (P<0.05) for paritytwo females than for those having 3-5 parities. The paternity test used nine microsatellite markers to genotype 300 piglets from 25 litters, but paternity exclusion was achieved for only 95 piglets, which did not differentiate boars across AI methods.(AU)

A inseminação artificial intra-uterina (IAIC) com reduzida concentração de espermatozóides por dose permite que o sêmen de um menor número de reprodutores seja usado em um maior número de fêmeas. Porém, o uso freqüente de pools de sêmen de dois ou mais machos na inseminação heterospérmica pode mascarar o baixo desempenho de alguns reprodutores. O objetivo deste estudo foi comparar o desempenho reprodutivo da IAIU com a inseminação artificial intracervical (IAIC), usando amostras heterospérmicas de sêmen, em condições de rotina de campo e através de teste de paternidade. A IAIC foi feita com 3,0 x 109 espermatozóides/85mL e a IAIU foi feita com 1,5 x 109 espermatozóides/60mL, ambas em grupos de 150 fêmeas. A IAIU apresentou taxas menores (P<0,05) de concepção (90,7%) e parição (85,3%) do que a IAIC (98,7% e 94,7%, respectivamente). O tamanho total da leitegada não diferiu (P>0,05) entre IAIC (13,7 ± 0,3) e IAIU (13,0 ± 0,3), mas foi mais alto nas fêmeas de segundo parto do que nas com 3-5 partos (P<0,05). O teste de paternidade usou nove microssatélites para a genotipagem de 25 leitegadas, totalizando 300 leitões, havendo exclusão de paternidade somente em 95 leitões, o que não permitiu diferenciação entre os machos, dentro das técnicas de IA.(AU)