Effects of Supplementation of Zinc, Manganese, or Copper and Different Phytase Levels in Serum and Bone Acid and Alkaline Phosphatases of Broiler Chicks

The knowledge of biological trace minerals and phytase requirements for modern broiler genotypes is not established and the pressure to reduce their usage in animal feeding due to environmental issues is increasing. Here, the alkaline phosphatase (ALP) and tartarate-resistant acid phosphatase (TRAP) of the tibia and serum of broilers fed with diets containing various levels of phytase and reduced levels of zinc, manganese, and copper was evaluated. The experiment was performed using 1,200 male Cobb broilers raised according to standard commercial husbandry techniques. Data were analyzed as a 4×3 factorial arrangement with four concentrations of zinc (0.34, 0.49, 0.64, and 0.79 ppm), manganese (0.18, 0.43, 0.68, and 0.93 ppm), or copper (0.09, 0.12, 0.15, and 0.18 ppm) and three concentrations of phytase (0, 500, and 1,000 FTU/kg) for age periods of 1-21 and 36-42 days. While the dietary supplementation with copper did not induce a significant effect in bone tissue biochemical markers, serum TRAP activity of 42-day old broilers increased with higher copper levels. Increasing dietary zinc levels linearly increased ALP activity in tibia growth, suggesting that zinc is essential for longitudinal bone growth. Phytase significantly promoted the increase of TRAP and ALP activities, suggesting that manganese increased growth plate activity, accelerated calcification, and remodeled the newly formed tissue into trabecular bone. Although not every enzymatic activity was affected by the treatments, the phytase use, along with trace minerals, improved the animal response to the rapid growth required nowadays and provided the nutrients for adequate bone metabolism.(AU)

Ativação de células de memória na produção de anticorpos e na expressão de células IgM positivas no baço de tilápias-do-nilo / Activation of memory cells in the antibody production and the expression of IgM positive cells in Nile tilapia spleen

O presente trabalho avaliou o papel do baço no armazenamento e na reativação das linhagens de células B, representadas por células IgM positivas imunomarcadas no tecido esplênico, bem como a funcionalidade dessas células, sobre a cinética dos linfócitos e na produção sistêmica de anticorpos em tilápias-do-nilo (Oreochromis niloticus). Foram separados dois grupos: grupo memória, constituído por peixes previamente imunizados com hemácia de carneiro a 2,5%, para a geração da memória imune, e o grupo naive, que recebeu o mesmo volume de solução salina a 0,65%. Após 32 dias, os dois grupos foram submetidos a uma nova dose do antígeno na mesma concentração, volume e via de inoculação. A reativação dos clones de memória foi evidenciada pelo aumento do número de células IgM positivas no baço do grupo memória no dia zero/pré-imune. Além disso, o mesmo grupo apresentou aumento dos títulos de anticorpos séricos no 14º dia e no número absoluto de linfócitos no 21º dia em relação ao grupo naive. Esses resultados sugerem que o baço não seja apenas um local de armazenamento, mas também de reativação de células B de memória em tilápia-do-nilo.(AU)

This work aimed to evaluate the role of the spleen in storage and reactivation of the memory B cells, represented by IgM positive cells and the systemic production of sheep antibodies anti-red cell in Nile tilapia (Oreochromis niloticus). Two groups were established: the memory group, containing fish previously immunized with a 2,5% sheep anti-red cell, to generate the immune memory; and the naive group, containing fish that received a 0,65% saline solution. After 32 days, both groups were subjected to a new dose of the same antigen at the same concentration, volume, and inoculation via. The memory clones reactivation was correlated to the increase of the IgM positive cells in the spleen in the memory group at 0 day. The memory group showed an increase in the absolute number of lymphocytes at 21 days and an increase in the antibodies at 14 days after inoculation when compared to the naive group. The results suggest that the spleen may be a storage and reactivation place of memory B cells in Nile tilapia.(AU)

Ativação de células de memória na produção de anticorpos e na expressão de células IgM positivas no baço de tilápias-do-nilo / Activation of memory cells in the antibody production and the expression of IgM positive cells in Nile tilapia spleen

O presente trabalho avaliou o papel do baço no armazenamento e na reativação das linhagens de células B, representadas por células IgM positivas imunomarcadas no tecido esplênico, bem como a funcionalidade dessas células, sobre a cinética dos linfócitos e na produção sistêmica de anticorpos em tilápias-do-nilo (Oreochromis niloticus). Foram separados dois grupos: grupo memória, constituído por peixes previamente imunizados com hemácia de carneiro a 2,5%, para a geração da memória imune, e o grupo naive, que recebeu o mesmo volume de solução salina a 0,65%. Após 32 dias, os dois grupos foram submetidos a uma nova dose do antígeno na mesma concentração, volume e via de inoculação. A reativação dos clones de memória foi evidenciada pelo aumento do número de células IgM positivas no baço do grupo memória no dia zero/pré-imune. Além disso, o mesmo grupo apresentou aumento dos títulos de anticorpos séricos no 14º dia e no número absoluto de linfócitos no 21º dia em relação ao grupo naive. Esses resultados sugerem que o baço não seja apenas um local de armazenamento, mas também de reativação de células B de memória em tilápia-do-nilo.(AU)

This work aimed to evaluate the role of the spleen in storage and reactivation of the memory B cells, represented by IgM positive cells and the systemic production of sheep antibodies anti-red cell in Nile tilapia (Oreochromis niloticus). Two groups were established: the memory group, containing fish previously immunized with a 2,5% sheep anti-red cell, to generate the immune memory; and the naive group, containing fish that received a 0,65% saline solution. After 32 days, both groups were subjected to a new dose of the same antigen at the same concentration, volume, and inoculation via. The memory clones reactivation was correlated to the increase of the IgM positive cells in the spleen in the memory group at 0 day. The memory group showed an increase in the absolute number of lymphocytes at 21 days and an increase in the antibodies at 14 days after inoculation when compared to the naive group. The results suggest that the spleen may be a storage and reactivation place of memory B cells in Nile tilapia.(AU)

Breeder age and bone development in broiler chicken embryos / Idade da matriz e desenvolvimento ósseo em embriões de frango de corte

The effect of breeder age on long bone development was studied in chicken embryos from 12 days of incubation until hatching. Fertile eggs were incubated and randomly assigned in a 2 x 6 factorial arrangement (two breeder ages - 38 and 60 weeks and six incubation days - 12, 14, 16, 18, 20, and 21). Enzymatic activity of acid and alkaline phosphatases in tibial epiphyses and weights as well as length and width in tibias and femurs of the embryos were determined. Tartrate-resistant acid and alkaline phosphatases activity in epiphyses was not affected by breeder age. Absolute weight and width of femur and tibia were larger in 60-week-old embryos compared to 38-week-old. Enzymatic activity and morphometric measurements increased with incubation day, independently of breeder age. The results showed that the process of endochondral ossification during the last two thirds of embryo development was not influenced by the age of the breeders. Although, in terms of absolute weight, the long bones of embryos from older breeders were heavier, which was associated with the larger width of the bones, but and not with their length.(AU)

O efeito da idade da matriz sobre o desenvolvimento dos ossos longos foi estudado em embriões de frango de 12 dias de incubação até o nascimento. Ovos férteis foram incubados e distribuídos em delineamento inteiramente casualizado em arranjo fatorial 2 x 6 (duas idades de matriz - 38 e 60 semanas e seis dias de incubação - 12, 14, 16, 18, 20 e 21 dias). Determinou-se a atividade enzimática das fosfatase alcalina e ácida-resistente ao tartrato no peso e nas epífises da tíbia, no comprimento e na largura da tíbia e do fêmur. A atividade das fosfatases não foi afetada pela idade da matriz. O peso absoluto e a largura de fêmur e tíbia foram maiores nos embriões das matrizes com 60 semanas de idade. Atividade enzimática e medidas morfométricas aumentaram com o dia de incubação independentemente da idade da matriz. Concluiu-se que o processo de ossificação endocondral durante os dois últimos terços de desenvolvimento embrionário não foi influenciado pela idade das matrizes. No entanto, em termos de peso absoluto, os ossos longos de embriões provenientes de matrizes velhas foram mais pesados o que foi associado à maior largura e não ao maior comprimento dos ossos.(AU)

Enzymatic activity of bone markers on Lithobates catesbeianus (Shaw, 1802) growth during the ossification process

Abstract In order to better understand the ossification processes in anurans our study was carried out on tadpoles and adults of Lithobates catesbeianus. In this sense, we characterized the kinetic properties of alkaline phosphatase with p-nitrophenylphosphatase (pNPP) and pyrophosphate (PPi) and evaluated the activities of tartrate-resistant acid phosphatase and acid phosphatase. The enzyme extracts were obtained from tadpoles and adult femurs, which were divided into epiphysis and diaphysis. After homogenization, the samples were submitted to differential centrifugation to obtain cell membranes and, further, to phospholipase C (PIPLC) treatment, to remove membrane-bound proteins anchored by phosphatidylinositol. The average of specific activity for pNPP hydrolysis (at pH 10.5) by alkaline phosphatase released by phosphatidylinositol-specific phospholipase C (PIPLC) from Bacillus cereus among different bone regions at different animal ages was 1,142.57 U.mg-1, while for PPi hydrolysis (at pH 8.0), it was 1,433.82 U.mg-1. Among the compounds tested for enzymatic activity, the one that influenced the most was EDTA, with approximately 67% of inhibition for pNPPase activity and 77% for PPase activity. In the case of kinetic parameters, the enzyme showed a Michaelian behavior for pNPP and PPi hydrolysis. The Km value was around 0.6mM for pNPPase activity and ranged from 0.01 to 0.11mM for PPase activity, indicating that the enzyme has a higher affinity for this substrate. The study of pNPP and PPi hydrolysis by the enzyme revealed that the optimum pH of actuation for pNPP was 10.5, while for PPi, which is considered the true substrate of alkaline phosphatase, was 8.0, close to the physiological value. The results show that regardless of the ossification type that occurs, the same enzyme or isoenzymes act on the different bone regions and different life stages of anurans. The similarity of the results of studies with other vertebrates shows that anurans can be considered excellent animal models for the study of biological calcification.

Resumo Para melhor compreender o processo de ossificação em anuros, nosso estudo foi conduzido em girinos e adultos de Lithobates catesbeianus. Nesse sentido, as propriedades cinéticas da fosfatase alcalina com p-nitrofenilfosfato (pNPP) e pirofosfato (PPi) foram caracterizadas, e as atividades enzimáticas das fosfatases ácida e ácida tartarato resistente foram avaliadas. Os extratos enzimáticos foram obtidos de fêmur de girinos e adultos, divididos em epífise e diáfise. Após a homogeneização as amostras foram submetidas à centrifugação diferencial para obter membrana celular e, em seguida, ao tratamento com fosfolipase C (PIPLC), para remover as proteínas de membrana ancoradas por fosfatidilinositol. A média da atividade específica da fosfatase alcalina, liberada pela PIPLC de Bacillus cereus, para a hidrólise de pNPP (pH 10,5) nas diferentes regiões do fêmur e idades dos animais foi de 1.142,57 U.mg-1, enquanto para a hidrólise do PPi (pH 8,0) foi de 1.433,82 U.mg-1. Entre os compostos testados para a atividade enzimática, o de maior influência foi o EDTA, inibindo aproximadamente 67% e 77% das atividades de pNPPase e PPase, respectivamente. Quanto aos parâmetros cinéticos, a enzima apresentou comportamento Michaeliano para a hidrólise dos dois substratos. O valor de Km foi de 0,6 mM para a atividade de pNPPase e variou de 0,01 a 0,11 para a atividade de PPase, indicando uma maior afinidade por esse substrato. O estudo da hidrólise de pNPP e PPi revelou que o pH ótimo aparente de atuação foi de 10,5 para o pNPP e 8,0 para o PPi, próximo ao fisiológico, sendo que esse é considerado o substrato natural da fosfatase alcalina. Os resultados demonstram que, apesar do tipo de ossificação que ocorre, a mesma enzima ou isoenzimas, atuam nos diferentes locais do osso e estágios de vida dos anuros. A similaridade dos estudos com os realizados com outros vertebrados apontam que os anuros podem ser considerados excelentes modelos animais para o estudo da calcificação biológica.

Enzymatic activity of bone markers on Lithobates catesbeianus (Shaw, 1802) growth during the ossification process / Atividade enzimática de marcadores ósseos no crescimento de Lithobates catesbeianus (Shaw, 1802) durante o processo de ossificação

Abstract In order to better understand the ossification processes in anurans our study was carried out on tadpoles and adults of Lithobates catesbeianus. In this sense, we characterized the kinetic properties of alkaline phosphatase with p-nitrophenylphosphatase (pNPP) and pyrophosphate (PPi) and evaluated the activities of tartrate-resistant acid phosphatase and acid phosphatase. The enzyme extracts were obtained from tadpoles and adult femurs, which were divided into epiphysis and diaphysis. After homogenization, the samples were submitted to differential centrifugation to obtain cell membranes and, further, to phospholipase C (PIPLC) treatment, to remove membrane-bound proteins anchored by phosphatidylinositol. The average of specific activity for pNPP hydrolysis (at pH 10.5) by alkaline phosphatase released by phosphatidylinositol-specific phospholipase C (PIPLC) from Bacillus cereus among different bone regions at different animal ages was 1,142.57 U.mg-1, while for PPi hydrolysis (at pH 8.0), it was 1,433.82 U.mg-1. Among the compounds tested for enzymatic activity, the one that influenced the most was EDTA, with approximately 67% of inhibition for pNPPase activity and 77% for PPase activity. In the case of kinetic parameters, the enzyme showed a "Michaelian" behavior for pNPP and PPi hydrolysis. The Km value was around 0.6mM for pNPPase activity and ranged from 0.01 to 0.11mM for PPase activity, indicating that the enzyme has a higher affinity for this substrate. The study of pNPP and PPi hydrolysis by the enzyme revealed that the optimum pH of actuation for pNPP was 10.5, while for PPi, which is considered the true substrate of alkaline phosphatase, was 8.0, close to the physiological value. The results show that regardless of the ossification type that occurs, the same enzyme or isoenzymes act on the different bone regions and different life stages of anurans. The similarity of the results of studies with other vertebrates shows that anurans can be considered excellent animal models for the study of biological calcification.

Resumo Para melhor compreender o processo de ossificação em anuros, nosso estudo foi conduzido em girinos e adultos de Lithobates catesbeianus. Nesse sentido, as propriedades cinéticas da fosfatase alcalina com p-nitrofenilfosfato (pNPP) e pirofosfato (PPi) foram caracterizadas, e as atividades enzimáticas das fosfatases ácida e ácida tartarato resistente foram avaliadas. Os extratos enzimáticos foram obtidos de fêmur de girinos e adultos, divididos em epífise e diáfise. Após a homogeneização as amostras foram submetidas à centrifugação diferencial para obter membrana celular e, em seguida, ao tratamento com fosfolipase C (PIPLC), para remover as proteínas de membrana ancoradas por fosfatidilinositol. A média da atividade específica da fosfatase alcalina, liberada pela PIPLC de Bacillus cereus, para a hidrólise de pNPP (pH 10,5) nas diferentes regiões do fêmur e idades dos animais foi de 1.142,57 U.mg-1, enquanto para a hidrólise do PPi (pH 8,0) foi de 1.433,82 U.mg-1. Entre os compostos testados para a atividade enzimática, o de maior influência foi o EDTA, inibindo aproximadamente 67% e 77% das atividades de pNPPase e PPase, respectivamente. Quanto aos parâmetros cinéticos, a enzima apresentou comportamento Michaeliano para a hidrólise dos dois substratos. O valor de Km foi de 0,6 mM para a atividade de pNPPase e variou de 0,01 a 0,11 para a atividade de PPase, indicando uma maior afinidade por esse substrato. O estudo da hidrólise de pNPP e PPi revelou que o pH ótimo aparente de atuação foi de 10,5 para o pNPP e 8,0 para o PPi, próximo ao fisiológico, sendo que esse é considerado o substrato natural da fosfatase alcalina. Os resultados demonstram que, apesar do tipo de ossificação que ocorre, a mesma enzima ou isoenzimas, atuam nos diferentes locais do osso e estágios de vida dos anuros. A similaridade dos estudos com os realizados com outros vertebrados apontam que os anuros podem ser considerados excelentes modelos animais para o estudo da calcificação biológica.