Does resveratrol preserve the integrity of the sperm membrane in goats after thawing? / O resveratrol preserva a integridade da membrana espermática de caprinos após descongelamento?

This study aimed to determine the effects of resveratrol in the trisaminomethane (TRIS)-egg yolk extender and its optimal inclusion level for goat semen cryopreservation. Five ejaculates of three Anglo Nubian goats were used, each divided into four 200 µL aliquots for use in four treatments: 0.00 (control), 0.04, 0.08 and 0.12 mg mL-¹ resveratrol in the TRIS-egg yolk extender. We evaluated progressive sperm motility and sperm vigor post-dilution, post-cooling, and post thawing; membrane integrity (HOST); and acrosomal integrity and performed a slow thermoresistance test (STT). The data were submitted to a regression analysis at a 5% probability. There was no difference in progressive motility or sperm vigor in the post-dilution (89.5, 89.0, 88.7 and 88.3, and 4.9, 5.0, 4.9, and 4.9) or post-cooling (81.0, 82.0, 83.0, and 78.3; and 4.3, 4.3, 4.2, and 4.2) experiments (P > 0.05), or in the complementary acrosomal integrity test (42.0, 47.4, 42.2 and 38.2) (P > 0.05). However, the motility and vigor parameters decreased linearly in the post-thaw phase, as well as during the 2 hours of incubation on STT (P < 0.05). These factors increased quadratically when resveratrol was added to HOST, to an optimal level of 0.039 mg mL-¹ resveratrol for a plasma membrane integrity of 52.55% (P < 0.05). The inclusion of resveratrol was effective in maintaining sperm viability; in particular, it was effective in maintaining plasmatic membrane integrity during the cryopreservation process up to 0.039 mg mL-1, meaning that it could be an alternative to conventionally used seminal extenders in goats.

O objetivo deste estudo foi determinar os efeitos e o melhor nível de inclusão de resveratrol em meio diluidor TRIS gema de ovo para criopreservação de sêmen caprino. Foram utilizados cinco ejaculados de três bodes da raça Anglo Nubiana. Cada ejaculado foi dividido em quatro alíquotas de 200 µL, compondo quatro tratamentos: 0,00 (controle); 0,04; 0,08 e 0,12mg mL-¹ de resveratrol no diluidor TRIS gema de ovo. Foram avaliadas a motilidade espermática progressiva e o vigor espermático pós diluição, pós-resfriamento e pós-descongelamento; integridade de membrana (HOST); integridade acrossomal e teste de termorresistência lento (TTR). Os dados foram submetidos à análise de regressão a 5% de probabilidade. Não houve diferença para a motilidade progressiva e o vigor espermático, respectivamente, na pós-diluição (89,5; 89,0; 88,7 e 88,3) e (4,9; 5,0; 4,9 e 4,9) e pós-resfriamento (81,0; 82,0; 83,0 e 78,3) e (4,3; 4,3; 4,2 e 4,2) (P 0,05). No entanto, os parâmetros motilidade e vigor reduziram linearmente no pós-descongelamento, assim como durante as 2 horas de incubação no TTR (P < 0,05). Houve efeito quadrático com a inclusão de resveratrol para HOST, apresentando um nível ótimo de 0,039mg mL-¹ de resveratrol para integridade de membrana plasmática de 52,55% (P <0,05). A inclusão de resveratrol foi eficiente na manutenção da viabilidade espermática; em especial, foi eficiente na manutenção da integridade da membrana plasmática durante o processo de criopreservação até o nível de 0,039mg mL-¹, podendo ser uma alternativa na composição dos diluidores seminais de caprinos.

Does resveratrol preserve the integrity of the sperm membrane in goats after thawing? / O resveratrol preserva a integridade da membrana espermática de caprinos após descongelamento?

This study aimed to determine the effects of resveratrol in the trisaminomethane (TRIS)-egg yolk extender and its optimal inclusion level for goat semen cryopreservation. Five ejaculates of three Anglo Nubian goats were used, each divided into four 200 µL aliquots for use in four treatments: 0.00 (control), 0.04, 0.08 and 0.12 mg mL-¹ resveratrol in the TRIS-egg yolk extender. We evaluated progressive sperm motility and sperm vigor post-dilution, post-cooling, and post thawing; membrane integrity (HOST); and acrosomal integrity and performed a slow thermoresistance test (STT). The data were submitted to a regression analysis at a 5% probability. There was no difference in progressive motility or sperm vigor in the post-dilution (89.5, 89.0, 88.7 and 88.3, and 4.9, 5.0, 4.9, and 4.9) or post-cooling (81.0, 82.0, 83.0, and 78.3; and 4.3, 4.3, 4.2, and 4.2) experiments (P > 0.05), or in the complementary acrosomal integrity test (42.0, 47.4, 42.2 and 38.2) (P > 0.05). However, the motility and vigor parameters decreased linearly in the post-thaw phase, as well as during the 2 hours of incubation on STT (P < 0.05). These factors increased quadratically when resveratrol was added to HOST, to an optimal level of 0.039 mg mL-¹ resveratrol for a plasma membrane integrity of 52.55% (P < 0.05). The inclusion of resveratrol was effective in maintaining sperm viability; in particular, it was effective in maintaining plasmatic membrane integrity during the cryopreservation process up to 0.039 mg mL-1, meaning that it could be an alternative to conventionally used seminal extenders in goats.(AU)

O objetivo deste estudo foi determinar os efeitos e o melhor nível de inclusão de resveratrol em meio diluidor TRIS gema de ovo para criopreservação de sêmen caprino. Foram utilizados cinco ejaculados de três bodes da raça Anglo Nubiana. Cada ejaculado foi dividido em quatro alíquotas de 200 µL, compondo quatro tratamentos: 0,00 (controle); 0,04; 0,08 e 0,12mg mL-¹ de resveratrol no diluidor TRIS gema de ovo. Foram avaliadas a motilidade espermática progressiva e o vigor espermático pós diluição, pós-resfriamento e pós-descongelamento; integridade de membrana (HOST); integridade acrossomal e teste de termorresistência lento (TTR). Os dados foram submetidos à análise de regressão a 5% de probabilidade. Não houve diferença para a motilidade progressiva e o vigor espermático, respectivamente, na pós-diluição (89,5; 89,0; 88,7 e 88,3) e (4,9; 5,0; 4,9 e 4,9) e pós-resfriamento (81,0; 82,0; 83,0 e 78,3) e (4,3; 4,3; 4,2 e 4,2) (P < 0,05), assim como para o teste complementar integridade acrossomal (42,0; 47,4; 42,2 e 38,2) (P > 0,05). No entanto, os parâmetros motilidade e vigor reduziram linearmente no pós-descongelamento, assim como durante as 2 horas de incubação no TTR (P < 0,05). Houve efeito quadrático com a inclusão de resveratrol para HOST, apresentando um nível ótimo de 0,039mg mL-¹ de resveratrol para integridade de membrana plasmática de 52,55% (P <0,05). A inclusão de resveratrol foi eficiente na manutenção da viabilidade espermática; em especial, foi eficiente na manutenção da integridade da membrana plasmática durante o processo de criopreservação até o nível de 0,039mg mL-¹, podendo ser uma alternativa na composição dos diluidores seminais de caprinos.(AU)

Ácido ascórbico no diluidor para criopreservação de sêmen caprino / Ascorbic acid in extender for cryopreservation of goat semen

Objetivou-se determinar o efeito e o melhor nível de inclusão de ácido ascórbico em meio diluidor TRIS-Gema para criopreservação de sêmen caprino. Foram utilizados cinco ejaculados de três bodes da raça Anglo Nubiana. Cada ejaculado foi dividido em quatro alíquotas de 200 μL, compondo quatro tratamentos: um sem adição de ácido ascórbico (controle) e os demais com 0,0528; 0,1056 e 0,1584mg/mL de ácido ascórbico no diluidor TRIS-Gema. Avaliaram-se motilidade espermática progressiva e vigor espermático pós-diluição, pós-resfriamento e pós-descongelamento; integridade de membrana (HOST); integridade acrossomal e teste de termorresistência lento (TTR). Os dados foram submetidos à Análise de Regressão a 5% de probabilidade. Não houve diferença para motilidade progressiva e para vigor espermático, repectivamente, na pós-diluição; pós-resfriamento e pós-descongelamento, assim como para os testes complementares HOST e após 120 minutos do TTR, para motilidade e vigor, no pós-descongelamento (P>0,05). Houve comportamento quadrático com a inclusão do ácido ascórbico para integridade acrossomal (61,58%), com nível ótimo de 0,1006mg/mL de ácido ascórbico (P<0,05). A inclusão de 0,1006mg/mL de ácido ascórbico no diluidor TRIS-Gema melhorou a integridade acrossomal durante o processo de criopreservação, podendo ser uma alternativa na composição dos diluidores seminais caprinos.

The objective of this study was to determine the optimal inclusion level of ascorbic acid in TRIS-yolk extenders for cryopreservation of goat semen. We used five ejaculates of three Anglo Nubian goats. Semen from each animal was divided into four 200μL aliquots, composing four treatments: no addition of ascorbic acid (control) and 0.0528, 0.1056, and 0.1584mg/mL of ascorbic acid in TRIS-egg yolk. We evaluated motility and sperm vigor after dilution, post-cooling, and post-thawing; membrane integrity (HOST); acrosomal integrity, and slow thermoresistance test (TRT). Data were subjected to regression analysis at 5% probability. There was no difference for the progressive motility and sperm vigor, respectively, in the post-dilution, after cooling and post-thawing, as well as the additional tests HOST and after 120 minutes of TRT, for motility and force, respectively, in post-thawing (P>0.05). There was a quadratic effect with the addition of ascorbic acid to the acrosome integrity parameter, presenting a great maximum level of 0.1006 mg/mL ascorbic acid for acrosome integrity of 61.58% (P<0.05). The addition of ascorbic acid was effective in maintaining sperm viability, especially acrosome integrity during the cryopreservation process until the level of 0.1006 mg/mL, and it may be an alternative composition of seminal extenders for goats.

Ácido ascórbico no diluidor para criopreservação de sêmen caprino / Ascorbic acid in extender for cryopreservation of goat semen

Objetivou-se determinar o efeito e o melhor nível de inclusão de ácido ascórbico em meio diluidor TRIS-Gema para criopreservação de sêmen caprino. Foram utilizados cinco ejaculados de três bodes da raça Anglo Nubiana. Cada ejaculado foi dividido em quatro alíquotas de 200 μL, compondo quatro tratamentos: um sem adição de ácido ascórbico (controle) e os demais com 0,0528; 0,1056 e 0,1584mg/mL de ácido ascórbico no diluidor TRIS-Gema. Avaliaram-se motilidade espermática progressiva e vigor espermático pós-diluição, pós-resfriamento e pós-descongelamento; integridade de membrana (HOST); integridade acrossomal e teste de termorresistência lento (TTR). Os dados foram submetidos à Análise de Regressão a 5% de probabilidade. Não houve diferença para motilidade progressiva e para vigor espermático, repectivamente, na pós-diluição; pós-resfriamento e pós-descongelamento, assim como para os testes complementares HOST e após 120 minutos do TTR, para motilidade e vigor, no pós-descongelamento (P>0,05). Houve comportamento quadrático com a inclusão do ácido ascórbico para integridade acrossomal (61,58%), com nível ótimo de 0,1006mg/mL de ácido ascórbico (P<0,05). A inclusão de 0,1006mg/mL de ácido ascórbico no diluidor TRIS-Gema melhorou a integridade acrossomal durante o processo de criopreservação, podendo ser uma alternativa na composição dos diluidores seminais caprinos.(AU)

The objective of this study was to determine the optimal inclusion level of ascorbic acid in TRIS-yolk extenders for cryopreservation of goat semen. We used five ejaculates of three Anglo Nubian goats. Semen from each animal was divided into four 200μL aliquots, composing four treatments: no addition of ascorbic acid (control) and 0.0528, 0.1056, and 0.1584mg/mL of ascorbic acid in TRIS-egg yolk. We evaluated motility and sperm vigor after dilution, post-cooling, and post-thawing; membrane integrity (HOST); acrosomal integrity, and slow thermoresistance test (TRT). Data were subjected to regression analysis at 5% probability. There was no difference for the progressive motility and sperm vigor, respectively, in the post-dilution, after cooling and post-thawing, as well as the additional tests HOST and after 120 minutes of TRT, for motility and force, respectively, in post-thawing (P>0.05). There was a quadratic effect with the addition of ascorbic acid to the acrosome integrity parameter, presenting a great maximum level of 0.1006 mg/mL ascorbic acid for acrosome integrity of 61.58% (P<0.05). The addition of ascorbic acid was effective in maintaining sperm viability, especially acrosome integrity during the cryopreservation process until the level of 0.1006 mg/mL, and it may be an alternative composition of seminal extenders for goats.(AU)

Centrifugação de espermatozoides ovinos em gradiente de densidade contínuo: efeito sobre a taxa de prenhez e proporção do sexo / Centrifugation of ovine sperm in continuous density gradient: effect on pregnancy rate and sex ratio

The objective of this study was to evaluate the efficiency of continuous density gradients of Percoll and OptiPrep for separation of X-bearing sperm, and assess the influence on sperm viability, pregnancy rate and sex ratio. With this purpose 100 million spermatozoa were deposited into each tube containing density gradient, which were previously prepared in polystyrene tubes, 24 hours before centrifugation and stored at 4 C. The tubes were centrifuged at 500xg for 15 minutes at 22 C, and then the supernatants aspirated and sperm recovered from the bottom of the tubes. A sample was evaluated before and after centrifugation to verify motility and sperm vigor. The sperm were used for fixed time artificial insemination. The results indicated that centrifugation did not affect sperm viability and pregnancy rate, however there was no deviation of sex ratio for females. More studies are needed of adapting the centrifugation technique to sheep and thus obtain the deviation of sex ration as in bovine.

Este trabalho teve como objetivo avaliar a eficiência de gradientes de densidade contínuos de Percoll e OptiPrep para a separação de espermatozoides portadores do cromossomo X, e avaliar a influência sobre a viabilidade espermática, taxa de prenhez e proporção do sexo. Para isso, 100 milhões de espermatozoides foram depositados em cada tubo contendo o gradiente de densidade, previamente preparados, em tubos de poliestireno, 24 horas antes da centrifugação e mantidos a 4 C. Centrifugou-se a 500 x g por 15 minutos a 22 C e, posteriormente, os sobrenadantes foram aspirados e os espermatozoides recuperados no fundo dos tubos. Uma amostra foi avaliada antes a após a centrifugação para verificação da motilidade e vigor espermático. Os espermatozoides foram utilizados para a inseminação artificial em tempo fixo. Os resultados indicaram que a centrifugação não afetou a viabilidade espermática e a taxa de prenhez, entretanto não houve desvio da proporção do sexo para fêmeas. Mais estudos são necessários para determinar a necessidade de adaptação da técnica de centrifugação para a espécie ovina e assim obter o desvio da proporção do sexo como na espécie bovina.

Centrifugação de espermatozoides ovinos em gradiente de densidade contínuo: efeito sobre a taxa de prenhez e proporção do sexo / Centrifugation of ovine sperm in continuous density gradient: effect on pregnancy rate and sex ratio

The objective of this study was to evaluate the efficiency of continuous density gradients of Percoll and OptiPrep for separation of X-bearing sperm, and assess the influence on sperm viability, pregnancy rate and sex ratio. With this purpose 100 million spermatozoa were deposited into each tube containing density gradient, which were previously prepared in polystyrene tubes, 24 hours before centrifugation and stored at 4 C. The tubes were centrifuged at 500xg for 15 minutes at 22 C, and then the supernatants aspirated and sperm recovered from the bottom of the tubes. A sample was evaluated before and after centrifugation to verify motility and sperm vigor. The sperm were used for fixed time artificial insemination. The results indicated that centrifugation did not affect sperm viability and pregnancy rate, however there was no deviation of sex ratio for females. More studies are needed of adapting the centrifugation technique to sheep and thus obtain the deviation of sex ration as in bovine.(AU)

Este trabalho teve como objetivo avaliar a eficiência de gradientes de densidade contínuos de Percoll e OptiPrep para a separação de espermatozoides portadores do cromossomo X, e avaliar a influência sobre a viabilidade espermática, taxa de prenhez e proporção do sexo. Para isso, 100 milhões de espermatozoides foram depositados em cada tubo contendo o gradiente de densidade, previamente preparados, em tubos de poliestireno, 24 horas antes da centrifugação e mantidos a 4 C. Centrifugou-se a 500 x g por 15 minutos a 22 C e, posteriormente, os sobrenadantes foram aspirados e os espermatozoides recuperados no fundo dos tubos. Uma amostra foi avaliada antes a após a centrifugação para verificação da motilidade e vigor espermático. Os espermatozoides foram utilizados para a inseminação artificial em tempo fixo. Os resultados indicaram que a centrifugação não afetou a viabilidade espermática e a taxa de prenhez, entretanto não houve desvio da proporção do sexo para fêmeas. Mais estudos são necessários para determinar a necessidade de adaptação da técnica de centrifugação para a espécie ovina e assim obter o desvio da proporção do sexo como na espécie bovina.(AU)

CENTRIFUGAÇÃO DE ESPERMATOZOIDES OVINOS EM GRADIENTE DE DENSIDADE CONTÍNUO: EFEITO SOBRE A TAXA DE PRENHEZ E PROPORÇÃO DO SEXO

The objective of this study was to evaluate the efficiency of continuous density gradients of Percoll and OptiPrep for separation of X-bearing sperm, and assess the influence on sperm viability, pregnancy rate and sex ratio. With this purpose 100 million spermatozoa were deposited into each tube containing density gradient, which were previously prepared in polystyrene tubes, 24 hours before centrifugation and stored at 4 °C. The tubes were centrifuged at 500xg for 15 minutes at 22 °C, and then the supernatants aspirated and sperm recovered from the bottom of the tubes. A sample was evaluated before and after centrifugation to verify motility and sperm vigor. The sperm were used for fixed time artificial insemination. The results indicated that centrifugation did not affect sperm viability and pregnancy rate, however there was no deviation of sex ratio for females. More studies are needed of adapting the centrifugation technique to sheep and thus obtain the deviation of sex ration as in bovine.

Este trabalho teve como objetivo avaliar a eficiência de gradientes de densidade contínuos de Percoll e OptiPrep para a separação de espermatozoides portadores do cromossomo X, e avaliar a influência sobre a viabilidade espermática, taxa de prenhez e proporção do sexo. Para isso, 100 milhões de espermatozoides foram depositados em cada tubo contendo o gradiente de densidade, previamente preparados, em tubos de poliestireno, 24 horas antes da centrifugação e mantidos a 4 °C. Centrifugou-se a 500 x g por 15 minutos a 22 °C e, posteriormente, os sobrenadantes foram aspirados e os espermatozoides recuperados no fundo dos tubos. Uma amostra foi avaliada antes a após a centrifugação para verificação da motilidade e vigor espermático. Os espermatozoides foram utilizados para a inseminação artificial em tempo fixo. Os resultados indicaram que a centrifugação não afetou a viabilidade espermática e a taxa de prenhez, entretanto não houve desvio da proporção do sexo para fêmeas. Mais estudos são necessários para determinar a necessidade de adaptação da técnica de centrifugação para a espécie ovina e assim obter o desvio da proporção do sexo como na espécie bovina.

Recycling of catheter for embryo recovery: a tool for costs reduction in equine embryo transfer / Reciclagem de cateteres para colheita de embrião em equinos: uma ferramenta para redução de custos

The embryo transfer is becoming a widespread practice. Most embryos are collected from spontaneous single ovulating mares and result in 50% of embryo recovery, increasing the costs of production. To illustrate, the price of a catheter for embryos recovery range from US$ 194.00 to US$ 250.00 (R$ 350.00 to R$ 450.00). Therefore, the aim of this work was to verify if catheter with damaged balloon can be recuperated and reused without altering its efficiency. For this study, two groups were used: a control group (GI, n=10), on which the nonsurgical recovery of the embryos of mares was performed with the catheter with original balloon; and another group (GII, n=20), in which a restored catheter was utilized. The mares of GI had an embryo recovery rate of 60%, and GII mares had an embryo recovery rate of 55%. There was not statistical difference between groups I and II (P>0.05). Considering that the material used to restore the catheter costs US$16.66 (R$30.00), this data show that the recuperation of the catheters for embryo recovery in mares may reduce costs without compromising the rates of embryo recovery.

A transferência de embriões está se tornando uma prática largamente utilizada. Apesar disso, na indústria de equinos, a colheita dos embriões é realizada a partir de ovulações simples, resultando em recuperação de, aproximadamente, 50%, o que aumenta os custos de produção. Cite-se como exemplo o custo do cateter para colheita do embrião, que varia de R$ 350,00 a R$ 450,00 (US$ 194,00 a US$ 250,00). Assim, com este trabalho objetivou-se verificar se cateteres com balão danificado podem ser recuperados sem alterar a sua eficiência. Para o estudo utilizaram-se dois grupos: controle (GI - n=10), em que a colheita não cirúrgica dos embriões das éguas foi realizada com cateter original; e o tratamento (GII - n=20), submetido à colheita do embrião com cateter recuperado. O custo do material utilizado para recuperar os cateteres foi de R$ 30,00 (US$ 16,66). Para as éguas do GI, obteve-se uma taxa de recuperação embrionária de 60% e no GII de 55%, não havendo diferença (P>0,05) entre os grupos. Considerando o baixo custo do material utilizado para recuperar os cateteres, conclui-se que sua recuperação, visando à reutilização na colheita de embrião de éguas, pode reduzir consideravelmente o custo final da técnica, sem comprometer as taxas de recuperação embrionária.

Recycling of catheter for embryo recovery: a tool for costs reduction in equine embryo transfer / Reciclagem de cateteres para colheita de embrião em equinos: uma ferramenta para redução de custos

The embryo transfer is becoming a widespread practice. Most embryos are collected from spontaneous single ovulating mares and result in 50% of embryo recovery, increasing the costs of production. To illustrate, the price of a catheter for embryos recovery range from US$ 194.00 to US$ 250.00 (R$ 350.00 to R$ 450.00). Therefore, the aim of this work was to verify if catheter with damaged balloon can be recuperated and reused without altering its efficiency. For this study, two groups were used: a control group (GI, n=10), on which the nonsurgical recovery of the embryos of mares was performed with the catheter with original balloon; and another group (GII, n=20), in which a restored catheter was utilized. The mares of GI had an embryo recovery rate of 60%, and GII mares had an embryo recovery rate of 55%. There was not statistical difference between groups I and II (P>0.05). Considering that the material used to restore the catheter costs US$16.66 (R$30.00), this data show that the recuperation of the catheters for embryo recovery in mares may reduce costs without compromising the rates of embryo recovery.(AU)

A transferência de embriões está se tornando uma prática largamente utilizada. Apesar disso, na indústria de equinos, a colheita dos embriões é realizada a partir de ovulações simples, resultando em recuperação de, aproximadamente, 50%, o que aumenta os custos de produção. Cite-se como exemplo o custo do cateter para colheita do embrião, que varia de R$ 350,00 a R$ 450,00 (US$ 194,00 a US$ 250,00). Assim, com este trabalho objetivou-se verificar se cateteres com balão danificado podem ser recuperados sem alterar a sua eficiência. Para o estudo utilizaram-se dois grupos: controle (GI - n=10), em que a colheita não cirúrgica dos embriões das éguas foi realizada com cateter original; e o tratamento (GII - n=20), submetido à colheita do embrião com cateter recuperado. O custo do material utilizado para recuperar os cateteres foi de R$ 30,00 (US$ 16,66). Para as éguas do GI, obteve-se uma taxa de recuperação embrionária de 60% e no GII de 55%, não havendo diferença (P>0,05) entre os grupos. Considerando o baixo custo do material utilizado para recuperar os cateteres, conclui-se que sua recuperação, visando à reutilização na colheita de embrião de éguas, pode reduzir consideravelmente o custo final da técnica, sem comprometer as taxas de recuperação embrionária.(AU)

Sexagem de espermatozóides bovinos por centrifugação em gradiente de densidade contínuo de Percoll e OptiPrep

Os objetivos deste trabalho foram de facilitar os procedimentos de formação de gradientes de- densidade de Percoll e OptiPrep para separação de espermatozóides X; avaliar a eficiência da sexagem de espermatozóides X, a viabilidade espermática e integridade do acrossoma e do DNA após a centrifugação nestes gradientes e avaliar taxa de clivagem e blastocisto durante a produção in vitro de embriões. Para isso, doses de sêmen de touros foram descongeladas e cerca de 40 milhões de espermatozóides foram colocados sobre cada gradiente de densidade compostos por Percoll ou OptiPrep com três camadas que variaram entre 1.11 Og/mL a 1.123g/mL em tubos de poliestireno de 15mL. Centrifugou-se o gradiente a 500xg por 15 min a 22°C. Os sobrenadantes foram aspirados e recuperados para verificação da viabilidade espermática e integridade do acrossoma, fragmentação do DNA, produção in vitro de embriões, avaliação da eficiência da sexagem pela reação em cadeia da polimerase quantitativa em tempo real (qPCR) e sexagem dos embriões pela PCR. A porcentagem de espermatozóides vivos com acrossoma intacto diminuiu (P<0,05) após a centrifugação nos gradientes de densidade, mas não influenciou, de modo geral, a produção in vitro de embriões (taxa de clivagem e blastocistos) utilizando estes espermatozóides centrifugados. Não foi detectada fragmentação do DNA dos espermatozóides nas amostras centrifugadas. Os resultados demonstraram que o Percoll enriqueceu as amostras com espermatozóides X (62% de fêmeas, P<0,05). No OptiPrep e grupo Controle a porcentagem de fêmeas foi de 47,1 e 48,7%, respectivamente. Estes resultados foram confirmados pela qPCR do DNA dos espermatozóides, com uma subestimação apenas no Percoll. Foi possível realizar a sexagem, por uma metodologia mais simples, facilitando o procedimento de centrifugação em gradiente de densidade e sem provocar danos aos espermatozóides

The objectives of this work were to facilitate the procedures of formation of density gradients of Percoll and OptíPrep for separation of X-bearing bovine spermatozoa; to evaluate the efficiency of sexing and viability of acrosome integrity and DNA after centrifugation in these gradients and to assess the cleavage and blastocyst rate during in vitro production of embryos. For this, frozen-thawed spermatozoa (20 to 40 millions) were deposited on each density gradient composed of Percoll or OptiPrep with three layers that varied between 1.110g/mL to 1.123g/mL, in 15mL polystyrene tubes. The tubes were centrifuged at 500xg for 15 min at 22oC. Supernatants were carefully aspirated and sediments recovered for verification of sperm quality, DNA fragmentation, in vitro fertilization of embryos, evaluation of the efficiency of sexing by real time polymerase chain reaction (qPCR) and sexing of embryos by PCR. Percentage of live spermatozoa with intact acrosome decreased (P<0.05) after centrifugation in density gradients, however, it not influence, in general, the production of embryos in vitro (cleavage and blastocyst rates) using these centrifuged sperm. No sperm DNA fragmentation was detected in centrifuged samples. The results of embryo sexing by PCR showed deviation to female in the Percoll group (62%, P<0.05). In the OptiPrep and Control group the percentage of females was 47.1 and 48.7%, respectively. These results were confirmed by qPCR of DNA of spermatozoa, with an underestimation only in the Percoll group. It was possible the sexing, by a simple approach, facilitating the process of the centrifugation in density gradient and without damage to sperm

Inibição do desenvolvimento de embriões produzidos in vitro por anticorpos anti H-Y em bovinos

Anticorpos anti H-Y foram produzidos em ratas da linhagem isogênica Wistar Furth, e utilizados no sistema de cultivo in vitro de embriões bovinos, com o objetivo de desviar a proporção sexual. As ratas foram imunizadas com leucócitos do baço de machos de mesma linhagem, e a atividade biológica dos anticorpos verificada por ELISA. Cento e trinta e quatro embriões foram produzidos in vitro e quando atingiram o estádio de mórula foram incubados em meio de cultivo contendo 5% de anticorpos anti H-Y a 38,5 °C com 5% de CO2, 5% de O2 e 90% de N2 , por um período de 24 horas. Os embriões do grupo controle foram cultivados nas mesmas condições, sem adição de anticorpos anti H-Y. Após o cultivo com anticorpos anti H-Y, os embriões foram classificados em dois grupos: 1) embriões inibidos que permaneceram no estádio de mórula (classificados como machos) e 2) embriões que se desenvolveram e houve a formação de blastocele (classificados como fêmeas). Conseguimos produzir anticorpos anti H-Y com títulos de até 1:2048. Dos 134 embriões produzidos, 79 embriões (58,96%) tiveram o desenvolvimento inibido, e 55 embriões (41,04%) não sofreram inibição. O sexo de 124 embriões pode ser verificado com a PCR para confirmação dos resultados. Das 78 mórulas, 49 (62,82%) eram do sexo masculino e dos 46 blastocistos, 22 (47,83%) eram do sexo feminino. No grupo controle a proporção sexual foi de 55,57% de embriões fêmeas e 44,43% de embriões machos, totalizando 70 embriões. O teste do Qui-quadrado indicou que somente na sexagem de mórulas obteve-se desvio da proporção sexual (P<0,05) em relação ao grupo controle. Os resultados da sexagem foram diferentes dos apresentados na literatura o que pode ser devido à qualidade morfológica inferior dos embriões produzidos in vitro comparada aos embriões produzidos in vivo, ou também, a influência do meio de cultivo

Anti-H-Y antibodies were produced in female rats of the isogenic strain Wistar Furth, immunized with spleen leukocytes of males of the same strain, and the biological activity of the antibody was verified by ELISA. One hundred and thirty four embryos were produced in vitro and when they reached the morula stage they were incubated with anti-H-Y antibodies at 38.5°C under 5% CO2, 5% O2 and 90% N2 , for a period 24 hours. The embryos in the control group were cultured under same conditions, without addition of the anti-H-Y antibodies. After culture of the embryos in the medium containing anti H-Y antibodies, they were classified in two groups: 1) arrested embryos that remained in morula stage (classified as male) and 2) embryos that developed and formaed a blastocoele (classified as female). With the isogenic rats used, had been antibodies were obtained with titers up to 1:2048. Of the 124 embryos, 79 of them (58.96%) were arrested, and 55 embryos (41.04%) were not. The sex of 124 embryos was identified by PCR. Of the 78 morulas, 49 (62.82%) were confirmed as being male sex and of the 46 blastocysts, 22 (47.83%) were confirmed as being of the female sex. In the control group the sexual ratio was of 55.57% of femle embryos and 44.43% of male embryos, totalizing 70 embryos. Using the Chi-Square Test it was possible to observe that in the sexing of morulas it was obtained only statistical difference (P<0.05) in relation to the sexual ratio of the control group, while for sexed blastocysts no statistical difference was detected. The different results found compared with those reported in the literature could be due to the poor morphogical quality of the in vitro produced embryos when compared with the in vivo produced ones, or also, to the influence of the culture medium used during the in vitro production of embryos with anti-H-Y antibodies