Resumo
Durante o processo de criopreservação os espermatozoides de garanhões sofrem danos osmóticos que são irreversíveis. Mesmo utilizando-se as melhores técnicas de criopreservação, este processo ainda é prejudicial às células espermáticas sendo em média a taxa de sobrevivência espermática em torno de 50%. Além disso, ainda há uma porcentagem de espermatozoides sobreviventes portadores de danos subletais, fazendo com que seja limitada a capacidade de sobrevivência das células espermáticas após a descongelação e como consequência existe uma queda na fertilidade. Está bem estabelecido que os espermatozoides de diferentes garanhões domésticos variam significativamente em criosensibilidade, este fato pode estar relacionado com o efeito do crioprotetor, assim como pode ter relação com o tamanho molecular do crioprotetor penetrante e curva de refrigeração utilizada. Enquanto o glicerol continua a ser o crioprotetor mais comum para espermatozoides, existem fatores limitantes pelo seu uso, incluindo danos na membrana através de um efeito osmótico, sendo assim, as amidas têm sido estudas com o objetivo de minimizar os efeitos causados pelo glicerol durante o processo de criopreservação, por apresentarem melhor crioproteção da membrana das células espermáticas. Sendo assim, a proposta desse trabalho foi avaliar diferentes crioprotetores em diferentes curvas de refrigeração sobre a qualidade do sêmen equino. Para tanto, o estudo foi realizado para avaliar o efeito dos crioprotetores glicerol, metilformamida, dimetilformamida e dimetilacetamida em concentração a 5% em quatro curvas de refrigeração: 1°C/min-1, 0,25°C/min-1, 4°C/min-1 com estabilização à 5°C de 15min e 75min em refrigeração automática através da Mini-Digitcool ZH 400. Como resultado, o glicerol foi o crioprotetor que possibilitou melhor motilidade progressiva assim como alto potencial mitocondrial, apesar disso, esse crioprotetor provocou mais lesões a membrana plasmática. Por outro lado, a dimetilformamida foi o crioprotetor que melhor protegeu a membrana das células espermáticas pós-descongelação. A curva que possibilitou melhor viabilidade espermática em associação da cinética, potencial mitocondrial e integridade da membrana foi a curva de 1°C/min-1.
During the cryopreservation process, sperm from stallions suffer osmotic damage that is irreversible. Even using the best cryopreservation techniques, this process is still harmful to sperm cells, with an average sperm survival rate of around 50%. In addition, there is still a percentage of surviving sperm with sublethal damage, causing the sperm cells' ability to survive after thawing to be limited and as a consequence there is a fall in fertility. It is well established that sperm from different domestic stallions vary significantly in cryosensitivity, this fact may be related to the effect of the cryoprotectant, as well as it may be related to the molecular size of the penetrating cryoprotectant and the cooling curve used. While glycerol remains the most common cryoprotectant for sperm, there are limiting factors for its use, including damage to the membrane through an osmotic effect, so amides have been studied with the aim of minimizing the effects caused by glycerol during cryopreservation process, as they present better cryoprotection of the sperm cell membrane. Thus, the purpose of this work was to evaluate different cryoprotectants in different refrigeration curves on the quality of equine semen. To this end, the study was carried out to evaluate the effect of cryoprotectants glycerol, methylformamide, dimethylformamide and dimethylacetamide in concentration at 5% in four refrigeration curves: 1°C/min-1, 0.25°C/min-1, 4°C/min-1 with stabilization at 5°C for 15min and 75min in automatic refrigeration through Mini-Digitcool ZH 400. As a result, glycerol was the cryoprotectant that enabled better progressive motility as well as high mitochondrial potential. cryoprotectant caused more damage to the plasma membrane. On the other hand, dimethylformamide was the cryoprotectant that best protected the membrane of sperm cells after thawing. The curve that enabled better sperm viability in association with kinetics, mitochondrial potential and membrane integrity was the 1°C/min-1 curve.
Resumo
O pênis é o órgão copulador e no garanhão é classificado como sendo músculo cavernoso, em que os espaços cavernosos são preenchidos de sangue durante a ereção. Nos testículos que ocorre a produção espermática, que são transportados pela rete testis até o epidídimo, onde sofrerão maturação, capacidade fertilizante e armazenados até a ejaculação. As glândulas sexuais acessórias são responsáveis pelos fluidos expelidos durante a ejaculação, denominado de plasma seminal, que se misturam às células espermáticas e formam o ejaculado. Cada uma dessas glândulas são responsáveis por uma determinada secreção que vai direcionar o ejaculado equino a ser dividido em três distintas frações: fração pré-espermática, produzida pelas glândulas bulbouretrais e próstata; fração rica em espermatozoides, produzida pelas secreções do epidídimo e por líquidos das ampolas dos ductos deferentes; fração pós-espermática ou fração pobre, formada por espermatozoides remanescentes no canal uretral e líquidos produzidos pelas vesículas seminais, o gel. Durante o processo fisiológico de cópula, ocorrem vários eventos denominados de ereção, em que o garanhão se excita por estímulos, emissão que caracteriza-se pela liberação de espermatozoides dentro da uretra pélvica, seguido da ejaculação com a expulsão do sêmen, o relaxamento e recolhimento do pênis. Normalmente, as colheitas de sêmen equino são realizadas de forma convencional, com vagina artificial fechada, em que todas as frações se misturam. Cada garanhão possui características individuais com relação à manutenção das células espermáticas durante a criopreservação, essas características podem estar relacionadas à produção do plasma seminal, assim como os vários componentes que os compõem. Sabe-se que existe um efeito deletério desempenhado pelos componentes do plasma seminal produzido principalmente pelas vesículas seminais, aos espermatozoides durante o processo de criopreservação, porém, esses fatores ainda são desconhecidos. Várias hipóteses são sugeridas, tais como, a redução na produção de lipídeos e os tipos de proteínas e íons presentes em cada uma das frações do ejaculado. Sabendo disso, a colheita fracionada pode trazer benefícios aos espermatozoides, de forma que as primeiras frações não tenham contato com o plasma seminal produzido pelas vesículas seminais. O presente trabalho objetiva revisar a colheita fracionada de sêmen em garanhões, assim como, seus benefícios para as células espermáticas que serão submetidas à criopreservação.
The penis is the copulatory organ and in the stallion it is classified as cavernous muscle and the cavernous spaces are filled with blood during erection. In the testicles occurs sperm production, that are transported through the rete testis to the epididymis, where they will suffer maturation, fertilizer capacity and will be stored until ejaculation. The accessory sex glands are responsible for the expelled fluids during ejaculation, named seminal plasma that are mixed with sperm cells and form the ejaculate. Each of these glands are responsible for a certain secretion that will divide equine semen into three distinct fractions: pre-sperm fraction, produced by the prostate and bulbourethral glands; rich fraction in sperm, produced by epididymal secretions and liquids from ampoules of the vas deferens; post-sperm fraction or poor fraction, consisting of sperm remaining in the urethral canal and liquids produced by the seminal vesicles, the gel. During the physiological process of mating, several events occur named erection, in which the stud is excited by stimuli emission which is characterized by the release of sperm into the pelvic urethra followed by ejaculation with the expulsion of semen, relaxation and gathering the penis. Typically, horse semen collections are performed in the conventional way, with a closed artificial vagina, where all the fractions are mixed. Each stud has individual characteristics related to the maintenance of sperm cells during the cryopreservation, these characteristics may be related to production of seminal plasma and to the components that form it as well. What is known is that there is a negative effect played by the seminal plasma components mainly produced by the seminal vesicles, to the sperm during cryopreservation process, however, these factors are still unknown. Several hypotheses are suggested such as the productions reduction of lipids and proteins and the types of ions present in each fraction of the ejaculate. Knowing this, the fractional collection may be beneficial to sperm, considering that the first fractions do not have contact with seminal plasma produced by the seminal vesicles. This work aims to review the semen fraction harvest in stallions, as well as its benefits for the sperm cells to be submitted to cryopreservation.