Resumo
A alta casuística e os desafios encontrado no tratamento da osteoartrite (OA) em equinos, tem impulsionado a comunidade científica na busca do tratamento mais efetivo. As células tronco mesenquimais derivadas de membrana sinovial (CTMMS) tem apresentado resultados promissores no tratamento de lesões articulares, especialmente por seu potencial de imunomodulação e reparação, mas que necessita de melhor compreensão. Sendo assim, o objetivo deste trabalho foi avaliar as características da imunomodulação e reparação após a aplicação intra-articular das CTMMS livres e encapsuladas em hidrogel de alginato em lesões articulares induzidas em equinos. Lesões condrais foram realizadas na tróclea medial do talus em quinze cavalos. No dia da indução os animais foram divididos em três grupos. Os grupos foram divididos em CTMMS encapsulada, CTMMS livres e controle. Foram realizadas avaliações clínicas, análise citológica, química e dosagem de citocinas no líquido sinovial (IL-1, IL-10, IL-6, INF-, TNF , Substância P, amilóide sérica A, TGF, IGF e PGE2), antes do defeito e 24, 48, 96, 168 e 336 horas. Após 150 dias da instituição dos tratamentos, foram realizadas avaliação in situ através da cirurgia artroscópica utilizando os escores ICRS e coletamos material para análise histológica escore de ODriscoll e imunohistoquímica para colágeno tipo II. O tratamento com CTMMS seja ela livre ou encapsulada reduziu o processo inflamatório articular. O grupo CTMMS encapsulada apresentou maior processo inflamatório inicial comparado com os demais grupos, em função do elevado número de neutrófilos, macrófagos, IL-6, IL-10, TNF e INF-. Na avaliação in situ da reparação da cartilagem, foi observado diferença estatística na avaliação global de reparo no CTMMS encapsulada. Na análise macroscópica coradas com hematoxilina-eosina e azul de toluidina, o CTMMS encapsulada e CTMMS livre, demonstraram diferentes graus da formação de fibrocartilagem, maior quantidade no CTMMS livre, no entanto as características morfológicas foram semelhantes a cartilagem nativa. As CTMMS encapsuladas em hidrogel de alginato demonstram ter maior potencial de imunomodulação por reduzir a contagem de linfócitos e macrófagos, aumentar a IL-10 e IL-6 no líquido sinovial, o que contribuiu de forma mais eficaz para o controle da inflamação e na reparação quando comparado ao grupo de CTMMS livres, provavelmente devido ao maior tempo de permanência das células encapsuladas dentro da articulação.
The high casuistry and the challenges encountered in the treatment of osteoarthritis (OA) in horses has driven the scientific community in the search for the most effective treatment. Mesenchymal stem cells derived from synovial membrane (MSCSM) have shown promising results in the treatment of joint lesions, especially for their potential for immunomodulation and repair, but need better understanding. Therefore, the objective of this work was to evaluate the characteristics of immunomodulation and repair after the intra-articular application of free and encapsulated MSCSM in alginate hydrogel in equine induced joint lesions. Chondral lesions were performed in the medial trochlea of the talus in fifteen horses. On the day of induction the animals were divided into three groups. The groups were divided into encapsulated MSCSM, free MSCSM and control. Clinical evaluations, cytological analysis, chemistry and cytokine dosage in the synovial fluid (IL-1, IL-10, IL-6, INF-, TNF , Substance P, amyloid serum A, TGF, IGF and PGE2) were performed before the defect and 24, 48, 96, 168 and 336 hours. After 150 days from the institution of treatment, in situ evaluation was performed through arthroscopic surgery using the ICRS scores and we collected material for histological analysis O'Driscoll score and immunohistochemistry for collagen type II. The treatment with MSCSM, either free or encapsulated, reduced the joint inflammatory process. The encapsulated MSCSM group presented a greater initial inflammatory process compared to the other groups, due to the high number of neutrophils, macrophages, IL-6, IL-10, TNF and INF-. In the in situ evaluation of the cartilage repair, a statistical difference was observed in the global evaluation of the encapsulated MSCSM repair. In the macroscopic analysis stained with hematoxylin-eosin and toluidine blue, the encapsulated MSCSM and free MSCSM demonstrated different degrees of fibrocartilage formation, greater amount in free MSCSM, however the morphological characteristics were similar to native cartilage. The MSCSM encapsulated in alginate hydrogel showed higher immunomodulation potential by reducing the lymphocyte and macrophage counts, increasing the IL-10 and IL-6 in the synovial fluid, which contributed more effectively to the control of inflammation and repair when compared to the group of free MSCSM, probably due to the longer stay of the encapsulated cells inside the joint
Resumo
Animais com lesão na cartilagem articular, decorrente da osteoartrite, apresentam-se como um desafio para a Medicina Veterinária, pois o reparo cartilagíneo nunca é completo quando técnicas convencionais de tratamento são utilizadas. Os avanços médicos e pesquisas relacionadas têm mostrado crescente interesse na utilização da terapia celular com células tronco mesenquimais derivadas da membrana sinovial (CTMMS) no tratamento destas lesões, buscando proporcionar total reparo da cartilagem lesada e promover a imunomodulação necessária para o controle do processo inflamatório. Além disso, existem dúvidas quanto à persistência, comportamento das células e a migração a outros locais inflamados. Desta forma este estudo teve como objetivo cultivar e avaliar a viabilidade de CTMMS encapsuladas em um arcabouço tridimensional composto de hidrogel de alginato (HA). Adicionalmente avaliar a migração celular utilizando o nanocristal Qtracker 655. Para isso, fragmentos de membrana sinovial foram coletados da articulação metatarsofalangeana de equinos por cirurgia astroscópica, submetidos à digestão enzimática e cultivados em monocamadas. As células foram encapsuladas em várias concentrações: 104; 204; 504; 105; 205 células em solução de alginato de sódio a 1,5% (w/v). Em seguida, fez-se o processo de gelatinização em CaCl2 (102 mM), permitindo a formação do HA, com posterior cultivo em meio DMEM Knockout durante quatro semanas. A viabilidade, proliferação e diferenciação das células foram realizadas através da dissolução das microcápsulas em citrato de sódio e contagem com azul de tripan, e a diferenciação através dos cortes histológicos corados com hematoxilina e eosina (HE) e azul de toluidina (AT). Para avaliar a migração celular in vivo utilizou-se a citometria de fluxo até os 21 dias e cortes histológicos em microscopia de fluorescência aos sete dias. Houve um aumento no número e na viabilidade das CTMs durante as quatro semanas de cultura nas microcápsulas com 104, 105 e 205 células. Através das análises histológicas dos HAs corados com azul de toluidina e HE foi possível observar a distribuição definida dos condrócitos no hidrogel, assemelhando-se a grupos isógenos e formação de matriz territorial. As células migraram expressivamente para membrana sinovial, sendo encontradas também em estruturas adjacentes, comprovando a quimiotaxia pela inflamação. Este estudo demonstrou a eficiência do HA como arcabouço para ser utilizado na cultura de CTMMS mantendo a viabilidade e estimulando a diferenciação condrogênica e o nanocristal mostrou ser eficiente na marcação das CTMMS, não alterando a sua viabilidade, permitindo avaliação da migração celular in vivo na articulação dos equinos.
Animals with joint cartilage damage resulting from osteoarthritis present a challenge for Veterinary Medicine, since cartilage repair is never complete when conventional treatment techniques are used. Medical advances and related research have shown increasing interest in the use of cell therapy with mesenchymal stem cells derived from the synovial membrane (MSCSM) in the treatment of these lesions, seeking to provide total repair of injured cartilage and to promote the immunomodulation necessary to control the inflammatory process. In addition, there are doubts about the persistence, behavior of cells and migration to other inflamed sites. In this way, this study aimed to cultivate and evaluate a viability of MSCSM encapsulated in a three-dimensional scaffold composed of alginate hydrogel (HA) 655. For this, fragments of synovial membrane were collected from the metatarsophalangeal joint of horses by astroscopic surgery, submitted to enzymatic digestion and cultured in monolayers. The cells were resuspended in various concentrations: 104; 204; 504; 105; 205 cells in 1.5% (w/v) sodium alginate solution. The gelatinization process was then carried out in CaCl2 (102 mM), allowing the formation of HA, with subsequent culturing in DMEM Knockout medium for four weeks. Cell viability, proliferation and differentiation were performed by dissolving microcapsules in sodium citrate and counting with trypan blue, and differentiation through histological sections stained with hematoxylin and eosin (HE) and toluidine blue (AT). To evaluate cell migration in vivo, flow cytometry was used up to 21 days and histological sections under fluorescence microscopy at 7 days. There was an increase in the number and viability of MSCs during the four weeks of culture in the microcapsules with 104, 105 and 205 cells. Through the histological analysis of HAs stained with toluidine blue and HE it was possible to observe the defined distribution of chondrocytes in the hydrogel, resembling isogenic groups and formation of a territorial matrix. The cells migrated expressively to synovial membrane, being also found in adjacent structures, proving chemotaxis by inflammation. This study demonstrated the efficiency of the HA as a scaffold to be used in the culture of MSCMS maintaining viability and stimulating the chondrogenic and nanocrystal differentiation was shown to be efficient in the labeling of the MSCMS, not altering its viability, allowing evaluation of cellular migration in vivo the equine joint. ¨¨