Obtaining partial purified xylose reductase from Candida guilliermondii

The enzymatic bioconversion of xylose into xylitol by xylose reductase (XR) is an alternative for chemical and microbiological processes. The partial purified XR was obtained by using the following three procedures: an agarose column, a membrane reactor or an Amicon Ultra-15 50K Centrifugal Filter device at yields of 40%, 7% and 67%, respectively.

A bioconversão enzimática da xilose em xilitol pela xilose redutase (XR) é uma alternativa para as vias química e microbiológica. Avaliouse a purificação parcial da XR, utilizando os três seguintes procedimentos: uma coluna de agarose, um reator com membrana ou tubos de ultracentrifugação Amicon Ultra-15 50K, com rendimento de 40%, 7% ou 67%, respectivamente.

Partial purification of glucose-6-phosphate dehydrogenase by aqueous two-phase poly(ethyleneglycol)/phosphate systems

Glucose-6-phosphate dehydrogenase (G6PDH) is an important enzyme used in biochemical and medical studies and in several analytical methods that have industrial and commercial application. This work evaluated the extraction of G6PDH in aqueous two-phase system (ATPS) of poly(ethyleneglycol) (PEG)/phosphate buffer, using as enzyme source a medium prepared through commercial baker's yeast disruption. Firstly, the effects of PEG molar mass on the enzyme partition and of homogenization and rest on the system equilibrium were investigated. Afterwards, several ATPS were prepared using statistical analysis (2² factorial design). The results, including kinetic and thermodynamic parameters for the G6PDH activity, showed partial purification of this enzyme in ATPS composed of 17.5% (w/w) PEG400 and 15.0% (w/w) phosphate. A high enzymatic recovery value (97.7%), a high partition coefficient (351), and an acceptable purification factor (2.28 times higher than in cell homogenate) were attained from the top phase. So, it was possible to attain an effective enzyme pre-purification by separating some contaminants with a simple method such as liquid-liquid extraction in aqueous two-phase systems (ATPS).

Glicose-6-fosfato desidrogenase (G6PDH) é uma importante enzima usada em estudos bioquímicos e médicos, bem como em diversos métodos analíticos com aplicação comercial e industrial. Neste trabalho foi avaliado a extração da G6PDH em sistemas de duas fases aquosas (ATPS) constituídos por poli(etilenoglicol) (PEG)/tampão fosfato, usando como fonte de enzima um meio preparado por rompimento de leveduras de panificação comercial. Inicialmente foram investigados os efeitos da massa molar do PEG na partição da enzima e da homogeneização e repouso no equilíbrio do sistema. Na sequência, diversos ATPS foram preparados usando análise estatística (planejamento fatorial 2²). Os resultados, incluindo parâmetros cinéticos e termodinâmicos para a atividade da G6PDH, indicaram parcial purificação desta enzima em ATPS constituídos por 17,5% (p/p) PEG400 e 15,0% (p/p) fosfato. Um alto valor de recuperação enzimática (97,7%), um alto coeficiente de partição (351), e um fator de purificação aceitável (2,28 vezes maior que em homogenato celular) foram obtidos na fase superior do sistema. Assim, foi possível alcançar uma pré-purificação eficaz da enzima separando alguns contaminadores aplicando um método simples tal como a extração líquido-líquido em sistemas bifásicos (ATPS).

Activity of glucose-fructose oxidoreductase in fresh and permeabilised cells of Zymomonas mobilis grown in different glucose concentrations

Previously grown cells of the ethanologenic bacterium Zymomonas mobilis produce sorbitol and gluconic acid, in reactions catalysed by the periplasmic enzymes glucose-fructose oxidoreductase (GFOR) and glucono-delta-lactonase (GL). The GFOR/GL system activity, in cells to be used in this bioconversion, depends on growth conditions. In batch runs, with initial glucose concentrations (S0) from 42 to 230 g/L, the highest specific and total GFOR/GL activities were obtained with S0 = 153 g/L (12.6 U/g cells and 62 U/L). Higher S0 led to decreasing activities in fresh cells. With S0 = 209 g/L, the final specific activity was only 7.0 U/g. After disruption of cells, however, an activity over 15 U/g was revealed. Since growth inhibition with S0 over 153 g/L was observed in batch mode, fed-batch runs, equivalent to a batch of 230 g/L, were done. Although no growth inhibition occurred in fed-batch cultivation, enzyme activity remained low (5.2 U/g). A further fed-batch experiment, carried out under low pressure to remove ethanol from the medium, resulted in a specific activity of 9.8 U/g and a total activity of 68.7 U/L. These results indicate that the low GFOR/GL activities in Z. mobilis cells grown on higher S0 were due to changes in the cell wall, caused by high concentration of ethanol, that hindered the transport of the substrate to the intracellular enzymes in biconversion runs. This conclusion was confirmed by bioconversion runs with cells cultivated under different conditions.

Sorbitol e ácido glucônico são produzidos por células previamente cultivadas da bactéria produtora de etanol Zymomonas mobilis pela ação das enzimas periplasmáticas glicose-frutose oxidorredutase (GFOR) e glucono-delta-lactonase (GL). A atividade de GFOR/GL em células a serem empregadas nesta bioconversão depende das condições de crescimento. Em cultivo em regime descontínuo, com concentrações iniciais de glicose (S0) entre 42 e 230 g/L, as maiores atividades específica e total de GFOR/GL foram obtidas com S0 = 153 g/L (12,6 U/g de células e 62 U/L), enquanto maiores S0 levaram a atividades decrescentes em células não tratadas. Com S0 = 209 g/L, a atividade específica final foi de 7 U/g, mas, após a ruptura das células, atividade superior a 15 U/g foi medida. Uma vez que em descontínuo observou-se inibição por substrato com S0 a partir de 153 g/L, ensaios em regime descontínuo alimentado, com glicose equivalente a 230 g/L em descontínuo, foram realizados. Embora a inibição pelo substrato tenha sido superada, a atividade permaneceu baixa (5,2 U/g). Um novo ensaio em descontínuo alimentado, conduzido sob baixa pressão para remover o etanol do meio, resultou em atividade específica de 9,8 U/g e total de 68,7 U/L. Estes resultados indicam que as baixas atividades em células de Z. mobilis cultivadas com maiores S0 se deveram a mudanças na parede celular, provocadas por concentrações elevadas de etanol, que dificultaram o transporte de substrato para as enzimas intracelulares durante a bioconversão. Esta conclusão foi confirmada em ensaios de bioconversão com células provenientes de cultivos em diferentes condições.

Infleunce of pH on the partition of glucose-6-phosphate dehydrogenase and hexokinase in aqueous two-phase system

Glucose-6-phosphate dehydrogenase (G6PDH) and hexokinase (HK) are important enzymes used in biochemical and medical studies and in several analytical methods. Aqueous two-phase system (ATPS) formed by a polymer solution and an electrolyte solution provides a method for the separation and purification of enzymes with several advantages, including biocompatibility and easy scale up of the process. In this work, the effects of different pH values on the storage stability and partitioning behavior (K, partition coefficient) of the enzymes G6PDH and HK from baker's yeast extract were investigated in ATPS. The results, obtained from the 17.5% PEG 400 : 15.0% phosphate system, showed that when the pH was increased from 5.0 to 8.8, the K HK increased 26-fold and the K G6PDH 2.2-fold. In the 20.0% PEG 1500 : 17.5% phosphate system, the K HK and K G6PDH increased 13 and 1.2-fold, when the pH value was increased from 3.8 to 8.8, respectively. This leads to the conclusion that the partition coefficient for both enzymes is favored by high pH values. A statistical analysis of the results was conducted to confirm this conclusion.

Glicose-6-fosfato desidrogenase (G6PDH) e hexoquinase (HK) são importantes enzimas usadas em estudos bioquímicos e médicos e em diversos métodos analíticos. Sistema de duas fases aquosas (SDFA) formado por uma solução polimérica e uma solução eletrolítica proporciona um método para separação e purificação de enzimas com diversas vantagens, incluindo biocompatibilidade, que pode ser facilmente escalonado para nível industrial. Neste trabalho, os efeitos de diferentes valores de pH na estabilidade e na partição (K, coeficiente de partição) por SDFA das enzimas G6PDH e HK, obtidas através de levedura de panificação, foram investigados. Os resultados, obtidos do sistema constituído por 17,5% de PEG 400 e 15,0% de fosfato, mostraram que com a elevação do pH de 5,0 para 8,8, o K HK aumentou 26 vezes e o K G6PDH 2,2 vezes. No sistema 20,0% PEG 1500 : 17,5% fosfato, quando o valor do pH variou de 3,8 para 8,8. os valores de K HK e K G6PDH aumentaram e 13 vezes e 1,2 vez, respectivamente. Isto permite concluir que o coeficiente de partição, para ambas as enzimas, é favorecido pela elevação do pH. Uma análise estatística dos resultados foi conduzida para confirmar esta conclusão.