Ferramentas para avaliação da funcionalidade da mitocôndria espermática / Tools for evaluating the functionality of sperm mitochondria

A mitocôndria é a principal fonte de energia para a motilidade e a homeostase espermática. Durante afosforilação oxidativa são produzidos metabólitos, denominados espécies reativas de oxigênio (EROs), as quaisdesempenham papel fundamental nos processos fisiológicos. No entanto, disfunções mitocondriais podem causardesequilíbrio entre a produção de EROs e os mecanismos antioxidantes, provocando o estresse oxidativo, letalpara a célula espermática. Assim, como essa organela está envolvida tanto nos processos fisiológicos quanto nospatológicos dos espermatozoides, fica clara a importância de se avaliar sua funcionalidade. Portanto, o objetivodesta revisão é descrever as possíveis técnicas de avaliação da funcionalidade das mitocôndrias espermáticas pormeio da atividade e do potencial da membrana mitocondrial, da mensuração dos níveis de ATP e ADP e damensuração dos níveis de cálcio.(AU)

Mitochondria are the major source of energy for sperm motility and to the homeostasis. During theoxidative phosphorylation metabolites called Reactive Oxygen Species (ROS), are produced and play a key rolefor the physiological processes. However, mitochondrial dysfunctions can cause an imbalance between ROSproduction and antioxidant mechanisms cause oxidative stress, lethal for spermatozoa. Thus, as this organelle isinvolved both in physiological or pathological processes of sperm, it is clear the importance of evaluating itsfunctionality. Therefore, the aim of this review is to describe the possible techniques for assessing functionalityof sperm mitochondria and these assessments of activity and mitochondrial membrane potential, measuring thelevels of ATP and ADP and measurement the levels of calcium.(AU)

Investigando a fragmentação não induzida e a susceptibilidade à fragmentação do DNA espermático: refinamento da avaliação espermática. Parte 2 / Investigating not induced fragmentation and susceptibility of sperm DNA: refinement of sperm evaluation. Second part

A integridade do DNA espermático está intimamente relacionada com a fertilidade. Técnicas queavaliam o DNA espermático possuem grande importância e potencial de serem aplicadas nas rotinas dasavaliações andrológicas. No entanto, são necessários maiores conhecimentos sobre as técnicas e seus princípiospara permitir que sejam empregadas apropriadamente de acordo com os objetivos e resultados esperados. Dessaforma, assim como abordado na Parte 1, nesta Parte 2 serão abordadas técnicas de avaliação do DNAespermático: TUNEL, laranja de acridina e Sperm Chromatin Structure Assay (SCSA). A técnica de TUNELfundamenta-se na adição de nucleotídeos modificados marcados com fluorescência às fitas fragmentadas. Atécnica avalia, portanto, diretamente a fragmentação de DNA da amostra. A sonda laranja de acridina é capaz dediferenciar, por meio de diferentes colorações, o DNA fragmentado do não fragmentado. Já a técnica de SCSAbaseia-se na imposição de um desafio ao espermatozoide; esta técnica avalia a susceptibilidade dosespermatozoides à fragmentação de DNA, sendo, portanto, uma avaliação indireta. A presente revisão permiteexpor a opinião dos autores sobre as diferentes técnicas e suas aplicações, mostrando o potencial emprego delasnos exames de rotina e nas pesquisas.(AU)

Sperm DNA integrity is directly related to male fertility. Techniques to assess sperm DNA are importantand have potential to be applied in routine evaluation of semen. However, the techniques and principles need tobe further studied to apply they correctly and to get relevant results. Thus, as discussed in Part 1, Part 2 willaddress evaluation techniques of sperm DNA: TUNEL, acridine orange and Sperm Chromatin Structure Assay(SCSA). TUNEL is based on addition of modified nucleotides labeled with fluorescence to fragmented tapesevaluating, therefore, directly, the DNA fragmentation of the sample. Acridine orange differentiates fragmentedDNA by different colors. On the other hand, SCSA are based on the imposition of a challenge to sperm. Thus,this technique assesses the susceptibility of sperm DNA fragmentation constituting indirect assessment. Thereview allows showing opinion of the authors about different techniques and their applications. Therefore,potential use of these techniques in routine exams and researches are addressed.(AU)

Investigando a compactação e a fragmentação não induzida do DNA espermático: refinamento da avaliação espermática parte 1 / Investigating condensation and not induced fragmentation of sperm DNA: Refinement of sperm evaluation first part

O DNA espermático possui papel essencial na reprodução, visto que danos no material genético podemprejudicar os processos de fecundação e desenvolvimento embrionário. Ademais, há evidências de que danos aoDNA podem ser causados por alterações epigenéticas. Entretanto, embora ainda não seja aplicada nas avaliaçõesandrológicas de rotina, faz-se essencial a avaliação do status de integridade do DNA espermático. Existemdiversas técnicas de avaliação com diferentes princípios e objetivos. A aplicação destas irá depender dosequipamentos disponíveis, do treinamento da equipe e das respostas a serem obtidas. Ainda, para a interpretaçãodos resultados obtidos, é necessário o conhecimento do princípio de análise de cada técnica. Assim, a presenterevisão, dividida em duas partes, tem por objetivo abordar diferentes técnicas de avaliação. As técnicasabordadas na parte 1 estão relacionadas às avaliações de compactação da cromatina (azul de toluidina, azul deanilina e cromomicina A3) e à avaliação direta da fragmentação de DNA (ensaio Cometa e teste de dispersão dacromatina modificado). Na parte 2, serão abordadas as técnicas de TUNEL, laranja de acridina e “SpermChromatin Structure Assay” (SCSA). Nesta revisão, serão abordados os princípios dos testes e a interpretaçãodos resultados baseados na literatura e nas pesquisas do grupo.(AU)

Sperm DNA has an important role on reproduction. Injuries in genetic material can impair thefertilization processes and embryonic development. Furthermore, there is evidence that DNA damage can becaused by epigenetic alterations. Although DNA evaluation in sperm analysis routine assessments is essential, itis not yet performed. There are numerous techniques of DNA evaluation with different principles and objectives.Application of these techniques will depend on the equipment available, the staff training and answers to berequired. To interpret the results, however, knowledge of each analysis technique is required. Therefore, thisreview, divided in two parts, aims to consider different techniques. The techniques that will be consideredthroughout the first part of review are: toluidine blue, aniline blue, A3 chromomycyn, Comet assay anddispersion test of modified chromatin. In the second part, it will be approached TUNEL, acridine orange andSperm Chromatin Structure Assay (SCSA) techniques. We will discuss the testes and the main results based onliterature and researches of our group.(AU)

Investigando a compactação e a fragmentação não induzida do DNA espermático: refinamento da avaliação espermática – parte 1 / Investigating condensation and not induced fragmentation of sperm DNA: Refinement of sperm evaluation – first part

O DNA espermático possui papel essencial na reprodução, visto que danos no material genético podemprejudicar os processos de fecundação e desenvolvimento embrionário. Ademais, há evidências de que danos aoDNA podem ser causados por alterações epigenéticas. Entretanto, embora ainda não seja aplicada nas avaliaçõesandrológicas de rotina, faz-se essencial a avaliação do status de integridade do DNA espermático. Existemdiversas técnicas de avaliação com diferentes princípios e objetivos. A aplicação destas irá depender dosequipamentos disponíveis, do treinamento da equipe e das respostas a serem obtidas. Ainda, para a interpretaçãodos resultados obtidos, é necessário o conhecimento do princípio de análise de cada técnica. Assim, a presenterevisão, dividida em duas partes, tem por objetivo abordar diferentes técnicas de avaliação. As técnicasabordadas na parte 1 estão relacionadas às avaliações de compactação da cromatina (azul de toluidina, azul deanilina e cromomicina A3) e à avaliação direta da fragmentação de DNA (ensaio Cometa e teste de dispersão dacromatina modificado). Na parte 2, serão abordadas as técnicas de TUNEL, laranja de acridina e “SpermChromatin Structure Assay” (SCSA). Nesta revisão, serão abordados os princípios dos testes e a interpretaçãodos resultados baseados na literatura e nas pesquisas do grupo.

Sperm DNA has an important role on reproduction. Injuries in genetic material can impair thefertilization processes and embryonic development. Furthermore, there is evidence that DNA damage can becaused by epigenetic alterations. Although DNA evaluation in sperm analysis routine assessments is essential, itis not yet performed. There are numerous techniques of DNA evaluation with different principles and objectives.Application of these techniques will depend on the equipment available, the staff training and answers to berequired. To interpret the results, however, knowledge of each analysis technique is required. Therefore, thisreview, divided in two parts, aims to consider different techniques. The techniques that will be consideredthroughout the first part of review are: toluidine blue, aniline blue, A3 chromomycyn, Comet assay anddispersion test of modified chromatin. In the second part, it will be approached TUNEL, acridine orange andSperm Chromatin Structure Assay (SCSA) techniques. We will discuss the testes and the main results based onliterature and researches of our group.

Ferramentas para avaliação da funcionalidade da mitocôndria espermática / Tools for evaluating the functionality of sperm mitochondria

A mitocôndria é a principal fonte de energia para a motilidade e a homeostase espermática. Durante afosforilação oxidativa são produzidos metabólitos, denominados espécies reativas de oxigênio (EROs), as quaisdesempenham papel fundamental nos processos fisiológicos. No entanto, disfunções mitocondriais podem causardesequilíbrio entre a produção de EROs e os mecanismos antioxidantes, provocando o estresse oxidativo, letalpara a célula espermática. Assim, como essa organela está envolvida tanto nos processos fisiológicos quanto nospatológicos dos espermatozoides, fica clara a importância de se avaliar sua funcionalidade. Portanto, o objetivodesta revisão é descrever as possíveis técnicas de avaliação da funcionalidade das mitocôndrias espermáticas pormeio da atividade e do potencial da membrana mitocondrial, da mensuração dos níveis de ATP e ADP e damensuração dos níveis de cálcio.

Mitochondria are the major source of energy for sperm motility and to the homeostasis. During theoxidative phosphorylation metabolites called Reactive Oxygen Species (ROS), are produced and play a key rolefor the physiological processes. However, mitochondrial dysfunctions can cause an imbalance between ROSproduction and antioxidant mechanisms cause oxidative stress, lethal for spermatozoa. Thus, as this organelle isinvolved both in physiological or pathological processes of sperm, it is clear the importance of evaluating itsfunctionality. Therefore, the aim of this review is to describe the possible techniques for assessing functionalityof sperm mitochondria and these assessments of activity and mitochondrial membrane potential, measuring thelevels of ATP and ADP and measurement the levels of calcium.

Investigando a fragmentação não induzida e a susceptibilidade à fragmentação do DNA espermático: refinamento da avaliação espermática. Parte 2 / Investigating not induced fragmentation and susceptibility of sperm DNA: refinement of sperm evaluation. Second part

A integridade do DNA espermático está intimamente relacionada com a fertilidade. Técnicas queavaliam o DNA espermático possuem grande importância e potencial de serem aplicadas nas rotinas dasavaliações andrológicas. No entanto, são necessários maiores conhecimentos sobre as técnicas e seus princípiospara permitir que sejam empregadas apropriadamente de acordo com os objetivos e resultados esperados. Dessaforma, assim como abordado na Parte 1, nesta Parte 2 serão abordadas técnicas de avaliação do DNAespermático: TUNEL, laranja de acridina e Sperm Chromatin Structure Assay (SCSA). A técnica de TUNELfundamenta-se na adição de nucleotídeos modificados marcados com fluorescência às fitas fragmentadas. Atécnica avalia, portanto, diretamente a fragmentação de DNA da amostra. A sonda laranja de acridina é capaz dediferenciar, por meio de diferentes colorações, o DNA fragmentado do não fragmentado. Já a técnica de SCSAbaseia-se na imposição de um desafio ao espermatozoide; esta técnica avalia a susceptibilidade dosespermatozoides à fragmentação de DNA, sendo, portanto, uma avaliação indireta. A presente revisão permiteexpor a opinião dos autores sobre as diferentes técnicas e suas aplicações, mostrando o potencial emprego delasnos exames de rotina e nas pesquisas.

Sperm DNA integrity is directly related to male fertility. Techniques to assess sperm DNA are importantand have potential to be applied in routine evaluation of semen. However, the techniques and principles need tobe further studied to apply they correctly and to get relevant results. Thus, as discussed in Part 1, Part 2 willaddress evaluation techniques of sperm DNA: TUNEL, acridine orange and Sperm Chromatin Structure Assay(SCSA). TUNEL is based on addition of modified nucleotides labeled with fluorescence to fragmented tapesevaluating, therefore, directly, the DNA fragmentation of the sample. Acridine orange differentiates fragmentedDNA by different colors. On the other hand, SCSA are based on the imposition of a challenge to sperm. Thus,this technique assesses the susceptibility of sperm DNA fragmentation constituting indirect assessment. Thereview allows showing opinion of the authors about different techniques and their applications. Therefore,potential use of these techniques in routine exams and researches are addressed.

O uso de ECG influencia a taxa de concepção em vacas Nelore de diferentes condições corporais submetidas ao mesmo protocolo de IATF? / Does ECG influence the conception rate Nelore cows presenting different body condition scores submitted to the same timed-AI protocol?

O objetivo deste estudo foi avaliar a taxa de concepção (TC) de vacas multíparas da raça Nelore apresentando diferentes escores de condição corporal (ECC), que foram submetidas ao mesmo protocolo de inseminação artificial em tempo fixo (IATF) com o emprego da gonadotrofina coriônica equina (eCG). Foram inseminadas 1574 vacas da raça Nelore, com 40 a 50 dias pós-parto. Durante as IATFs, os dados referentes ao touro (n = 8), inseminador (n = 3) e ECC foram anotados, sendo a nota do ECC aferida de 1 a 5 por técnico experiente. O diagnóstico de gestação foi realizado, por ultrassonografia, 40 dias após a IATF. Não foi observado efeito (P > 0,05) de inseminador ou touro na TC. Também não se observou diferença estatística desta taxa entre os grupos de animais separados de acordo com os ECCs. O grupo de animais com menor ECC (Grupo 1 = ECC 1,5 a 2,0; n = 139) apresentou TC de 47,4%. Os grupos de animais com ECC entre 2,5 a 2,75 (Grupo 2; n = 741) e com ECC entre 3,0 a 3,25 (Grupo 3; n = 463) apresentaram, respectivamente, TC de 47,6% e 51,2%. Os grupos de animais com maior ECC (Grupo 4 = ECC 3,5 a 4,0; n = 231) apresentou TC de 45,3% (P > 0,05). Concluiu-se que as taxas de concepção foram semelhantes entre os animais apresentando diferentes ECC no rebanho, provavelmente pelo eCG compensar a baixa pulsatilidade de LH dos animais mais magros. Porém, recomenda-se maiores estudos para verificar a real necessidade do uso de eCG em animais de condição corporal superior a 3,5.

The aim of this study was to evaluate the conception rate (CR) of multiparous Nelore cows presenting different body condition scores (BCS), which were submitted to the same Timed-AI protocol with equine chorionic gonadotrophin (eCG). A total of 1574 cows were inseminated, between 40 and 50 days postpartum. During insemination (timed-AI), all data regarding to bull (n=8), inseminator (n=3) and BCS (1 to 5) were recorded. The pregnancy diagnosis was performed, by ultrasonography, 40 days after timed-AI. No effect (P>0.05) of inseminator or bull was observed. No statistical difference was also observed between the groups of animals with different BCS. The animals with lower BCS (Group 1 = BCS 1.5 to 2.0; n = 139) had a CR of 47.4%. The animals with BCS from 2.5 to 2.75 (Group 2; n = 741) and BCS from 3.0 to 3.25 (Group 3; n = 463) had a CR of 47.6% and 51.2%, respectively. The animals with higher BCS (Group 4 = BCS 3.5 to 4.0; n = 231) had a CR of 45.3% (P > 0.05). It was concluded that conception rates were similar between the animals presenting different BCS in the herd, likely because the eCG minimized the effects of low LH pulsatility in animals presenting reduced nutritional condition. However, other studies are recommended to verify the real need of using eCG in animals with body condition exceeding 3.5.

O uso de ECG influencia a taxa de concepção em vacas Nelore de diferentes condições corporais submetidas ao mesmo protocolo de IATF? / Does ECG influence the conception rate Nelore cows presenting different body condition scores submitted to the same timed-AI protocol?

O objetivo deste estudo foi avaliar a taxa de concepção (TC) de vacas multíparas da raça Nelore apresentando diferentes escores de condição corporal (ECC), que foram submetidas ao mesmo protocolo de inseminação artificial em tempo fixo (IATF) com o emprego da gonadotrofina coriônica equina (eCG). Foram inseminadas 1574 vacas da raça Nelore, com 40 a 50 dias pós-parto. Durante as IATFs, os dados referentes ao touro (n = 8), inseminador (n = 3) e ECC foram anotados, sendo a nota do ECC aferida de 1 a 5 por técnico experiente. O diagnóstico de gestação foi realizado, por ultrassonografia, 40 dias após a IATF. Não foi observado efeito (P > 0,05) de inseminador ou touro na TC. Também não se observou diferença estatística desta taxa entre os grupos de animais separados de acordo com os ECCs. O grupo de animais com menor ECC (Grupo 1 = ECC 1,5 a 2,0; n = 139) apresentou TC de 47,4%. Os grupos de animais com ECC entre 2,5 a 2,75 (Grupo 2; n = 741) e com ECC entre 3,0 a 3,25 (Grupo 3; n = 463) apresentaram, respectivamente, TC de 47,6% e 51,2%. Os grupos de animais com maior ECC (Grupo 4 = ECC 3,5 a 4,0; n = 231) apresentou TC de 45,3% (P > 0,05). Concluiu-se que as taxas de concepção foram semelhantes entre os animais apresentando diferentes ECC no rebanho, provavelmente pelo eCG compensar a baixa pulsatilidade de LH dos animais mais magros. Porém, recomenda-se maiores estudos para verificar a real necessidade do uso de eCG em animais de condição corporal superior a 3,5. (AU)

The aim of this study was to evaluate the conception rate (CR) of multiparous Nelore cows presenting different body condition scores (BCS), which were submitted to the same Timed-AI protocol with equine chorionic gonadotrophin (eCG). A total of 1574 cows were inseminated, between 40 and 50 days postpartum. During insemination (timed-AI), all data regarding to bull (n=8), inseminator (n=3) and BCS (1 to 5) were recorded. The pregnancy diagnosis was performed, by ultrasonography, 40 days after timed-AI. No effect (P>0.05) of inseminator or bull was observed. No statistical difference was also observed between the groups of animals with different BCS. The animals with lower BCS (Group 1 = BCS 1.5 to 2.0; n = 139) had a CR of 47.4%. The animals with BCS from 2.5 to 2.75 (Group 2; n = 741) and BCS from 3.0 to 3.25 (Group 3; n = 463) had a CR of 47.6% and 51.2%, respectively. The animals with higher BCS (Group 4 = BCS 3.5 to 4.0; n = 231) had a CR of 45.3% (P > 0.05). It was concluded that conception rates were similar between the animals presenting different BCS in the herd, likely because the eCG minimized the effects of low LH pulsatility in animals presenting reduced nutritional condition. However, other studies are recommended to verify the real need of using eCG in animals with body condition exceeding 3.5. (AU)

Aspects related to the technique and the utilization of sexed semen in vivo and in vitro

The development of methods capable of selecting the sex of animals has always been a great challenge for humankind. Separating X chromosome- bearing and Y chromosome-bearing sperm based on DNA difference using flow cytometry is the only technique that has achieved a useful level of progress, especially in cattle. This allowed the technique to be commercially applicable in this species. Thorough this review, aspects related to the sexing technique (flow cytometry) and to the sperm will be discussed along with the in vitro use of sexed semen. Besides, number of sperm used and semen deposition location, the influence of reproductive status (heifers vs. cows), time of insemination and production of embryos in superovulated donors will be reviewed.

Aspects related to the technique and the utilization of sexed semen in vivo and in vitro

The development of methods capable of selecting the sex of animals has always been a great challenge for humankind. Separating X chromosome- bearing and Y chromosome-bearing sperm based on DNA difference using flow cytometry is the only technique that has achieved a useful level of progress, especially in cattle. This allowed the technique to be commercially applicable in this species. Thorough this review, aspects related to the sexing technique (flow cytometry) and to the sperm will be discussed along with the in vitro use of sexed semen. Besides, number of sperm used and semen deposition location, the influence of reproductive status (heifers vs. cows), time of insemination and production of embryos in superovulated donors will be reviewed.(AU)

Métodos de avaliação da morfologia e função espermática: momento atual e desafios futuros / Methods of the assessment of morphology and function of sperm: actual moment and future challenges

Com o propósito de obter resultados que demonstrem maior repetibilidade na avaliação da morfologia tanto quanto na função espermática, diversas técnicas laboratoriais tem sido desenvolvidas. Surgiram sistemas que utilizam a análise computadorizada de imagens, métodos de “coloração” empregando corantes fluorescentes (sondas fluorescentes) em microscopia de epifluorescência ou citometria de fluxo, que aumentaram a possibilidade de uma análise mais criteriosa da integridade estrutural dos espermatozóides. Os autores descrevem experiências, por mais de uma década, com a utilização destas biotécnicas, fazendo uma análise crítica, bem como apontando os desafios futuros, inclusive na área de biologia molecular espermática.(AU)

In order to obtain results showing greater repeatability in morphology and sperm function assessment, several laboratorial techniques have been developed continuously. Systems that utilize computerized image analysis, staining methods using fluorescent dies (fluorescent probes) in epifluorescence microscopy or flow cytometry, that allowed a more judicious evaluation of sperm structure integrity arose. Authors describe experiences, over a decade, with the use of these biotechiques, critically analyzing and pointing out future challenges, including the field of sperm molecular biology.(AU)

Métodos de avaliação da morfologia e função espermática: momento atual e desafios futuros / Methods of the assessment of morphology and function of sperm: actual moment and future challenges

Com o propósito de obter resultados que demonstrem maior repetibilidade na avaliação da morfologia tanto quanto na função espermática, diversas técnicas laboratoriais tem sido desenvolvidas. Surgiram sistemas que utilizam a análise computadorizada de imagens, métodos de “coloração” empregando corantes fluorescentes (sondas fluorescentes) em microscopia de epifluorescência ou citometria de fluxo, que aumentaram a possibilidade de uma análise mais criteriosa da integridade estrutural dos espermatozóides. Os autores descrevem experiências, por mais de uma década, com a utilização destas biotécnicas, fazendo uma análise crítica, bem como apontando os desafios futuros, inclusive na área de biologia molecular espermática.

In order to obtain results showing greater repeatability in morphology and sperm function assessment, several laboratorial techniques have been developed continuously. Systems that utilize computerized image analysis, staining methods using fluorescent dies (fluorescent probes) in epifluorescence microscopy or flow cytometry, that allowed a more judicious evaluation of sperm structure integrity arose. Authors describe experiences, over a decade, with the use of these biotechiques, critically analyzing and pointing out future challenges, including the field of sperm molecular biology.

Simultaneous assessment of plasmatic, acrosomal, and mitochondrial membranes in ram sperm by fluorescent probes / Avaliação simultânea das membranas plasmática, acrossomal e mitocondrial de espermatozoides de carneiros por sondas fluorescentes

In this experiment, it was defined a protocol of fluorescent probes combination: propidium iodide (PI), fluorescein isothiocyanate-conjugated Pisum sativum agglutinin (FITC-PSA), and JC-1. For this purpose, four ejaculates from three different rams (n=12), all showing motility >80 percent and abnormal morphology <10 percent, were diluted in TALP medium and split into two aliquots. One of the aliquots was flash frozen and thawed in three continuous cycles, to induce damage in cellular membranes and to disturb mitochondrial function. Three treatments were prepared with the following fixed ratios of fresh semen:flash frozen semen: 0:100 (T0), 50:50 (T50), and 100:0 (T100). Samples were stained in the proposal protocol and evaluated by epifluorescence microscopy. For plasmatic membrane integrity, detected by PI probe, it was obtained the equation: v=1.09+0.86X (R²=0.98). The intact acrosome, verified by the FITC-PSA probe, produced the equation: v=2.76+0.92X (R²=0.98). The high mitochondrial membrane potential, marked in red-orange by JC-1, was estimated by the equation: v=1.90+0.90X (R²=0.98). The resulting linear equations demonstrate that this technique is efficient and practical for the simultaneous evaluations of the plasmatic, acrosomal, and mitochondrial membranes in ram spermatozoa.(AU)

Neste experimento, foi definida uma combinação de sondas fluorescentes: iodeto de propídio (PI), aglutinina de Pisum sativum conjugada ao isotiocionato de fluoresceína (FITC-PSA) e JC-1. Para esta proposta, quatro ejaculados de três carneiros (n=12), que apresentavam motilidade >80 por cento e alterações morfológicas <10 por cento, foram diluídos em meio TALP e divididos em duas alíquotas. Uma alíquota foi submetida a três ciclos de flash frozen e descongelação, para induzir danos nas membranas celulares e distúrbios na função mitocondrial. Três tratamentos foram preparados com as seguintes proporções preestabelecidas de sêmen fresco: sêmen submetido a flash frozen: 0:100 (T0), 50:50 (T50) e 100:0 (T100). As amostras foram coradas no protocolo proposto e avaliadas por microscopia de epifluorescência. Para integridade de membrana plasmática, detectada pela sonda PI, foi obtida a equação: v=1,09+0,86X (R²=0,98). O acrossomo intacto, verificado pela sonda FITC-PSA, produziu a equação: v=2,76+0,92X (R²=0,98). O alto potencial de membrana mitocondrial, marcada em vermelho-alaranjado pelo JC-1, foi estimado pela equação: v=1,90+0,90X (R²=0,98). As equações lineares resultantes demonstraram que a técnica é eficiente e prática para avaliação simultânea das membranas plasmática, acrossomal e mitocondrial em espermatozoides de carneiros.(AU)