Avaliação de uma estirpe não toxigênica para prevenção de diarreia neonatal em leitões por clostridioides ( clostridium ) difficile

Clostridioides (Clostridium) difficile é um dos maiores causadores de diarreia neonatal em suínos e estudos tem apontado para um possível potencial zoonótico deste microrganismo. Apesar da importância do patógeno, não existem medidas específicas para a prevenção e controle da infecção por C. difficile (ICD). Desta forma, o objetivo do presente estudo foi caracterizar genotipicamente e avaliar o potencial de proteção de uma estirpe não toxigênica de C. difficile (NTCD), nomeada de Z31, contra a ICD em suínos. Para tal, o estudo foi dividido em cinco etapas: (1) Caracterização genotípica da estirpe Z31; (2) Avaliação da capacidade preventiva da estirpe Z31 contra a ICD em modelo experimental suíno; (3) Avaliação da capacidade preventiva da estirpe Z31 contra a ICD em uma granja comercial; (4) Avaliação de cinco meios de cultura para a produção e esporulação da estirpe Z31; e (5) Avaliação da viabilidade temporal de esporos liofilizados da estirpe Z31. O sequenciamento genômico revelou que a estirpe Z31 possui um cromossomo circular de 4.298.263 pares de base (bp), contendo genes responsáveis por produção e estabilidade dos esporos (spo0A), aderência intestinal (slpA) e formação de biofilme (fliD), porém, ausência dos genes codificadores das toxinas. Em modelo experimental em suínos neonatos, a Z31 preveniu a ICD, reduzindo os sinais clínicos, as lesões macro e microscópicas e a eliminação fecal do agente. Em uma granja comercial, mesmo na presença de outros enteropatógenos, a Z31 reduziu a ocorrência de ICD, a eliminação fecal de C. difficile toxigênico e a ocorrência de diarreia neonatal suína. Os meios BHI e RCM proporcionaram as maiores taxas de crescimento in vitro da estirpe Z31, atingindo concentrações de 6,57 × 106 UFC/mL com proporção de esporos superiores a 98%. Quando liofilizada, a estirpe Z31 manteve uma viabilidade aceitável tanto em temperatura ambiente quanto resfriada, de forma que 40-50% da carga total ainda se encontrava viável após 2 anos de armazenamento. Como conclusão, a estirpe Z31 foi capaz de prevenir a ICD em suínos e demonstrou características desejáveis para o seu potencial uso comercial.

Clostridioides (Clostridium) difficile is one of the main causes of porcine neonatal diarrhea and studies has shown the possible zoonotic potential of this microorganism. Despite the importance of this pathogen, there are no specific measures for the prevention and control of C. difficile infection (CDI). Thus, the aim of the present study was to characterize genotypically and evaluate the protective potential of a non-toxigenic C. difficile strain (NTCD), named Z31, against CDI in piglets. For this purpose, the study was divided into five stages: (1) Genotypic characterization of the strain Z31; (2) Evaluation of the preventive capacity of the strain Z31 against the CDI in experimental pig model; (3) Evaluation of the preventive capacity of the strain Z31 against CDI in a commercial farm; (4) Evaluation of five culture media for the production and sporulation of the strain Z31; and (5) Evaluation of the temporal viability of freeze-dried spores of the strain Z31. Genomic sequencing revealed that the strain Z31 has a circular chromosome of 4,298,263 base pairs (bp) containing genes responsible for spore production and stability (spo0A), intestinal adhesion (slpA) and biofilm formation (fliD), but absence of toxins encoding genes. In an experimental model in neonatal pigs, the strain Z31 prevented CDI, reducing clinical signs, macro and microscopic lesions and fecal elimination of the agent. In a commercial farm, even in the presence of other enteropathogens, the Z31 reduced the occurrence of CDI, the fecal elimination of toxigenic C. difficile and the occurrence of neonatal porcine diarrhea. The BHI and RCM media provided the highest in vitro growth rates of the strain Z31, reaching concentrations of 6.57 × 106 CFU/ml with spore ratio greater than 98%. After lyophilization, the strain Z31 maintained acceptable viability at both, ambient and cooled temperatures, so that 40-50% of the total charge was still viable after 2 years of storage. In conclusion, the strain Z31 was able to prevent CDI in pigs and demonstrated desirable characteristics for its potential commercial use.

PREVENÇÃO DA INFECÇÃO POR Clostridium difficile EM HAMSTERS UTILIZANDO UMA ESTIRPE NÃO TOXIGÊNICA

Os objetivos do trabalho foram caracterizar cinco estirpes não toxigênicas de Clostridium difficile (NTCD), avaliar a viabilidade temporal de esporos liofilizados e prevenir a infecção por C. difficile (ICD) em hamsters utilizando uma estirpe NTCD. Foram realizadas PCR e ELISA para confirmação do perfil toxigênico, testes de produção de esporos in vitro e avaliação do perfil de resistência a antimicrobianos. Uma estirpe foi selecionada e liofilizada em várias alíquotas, as quais foram mantidas a 4 e 20°C e submetidas a três métodos de contagem de esporos mensalmente. Um total de 107 esporos da estirpe NTCD foi administrada em hamsters previamente tratados com clindamicina. O desafio com 108 esporos de uma estirpe toxigênica de C. difficile ocorreu 12 e 48 horas após a administração da estirpe NTCD e os animais foram observados por 28 dias. As estirpes foram confirmadas como não toxigênicas, apresentaram resistência a clindamicina e lincomicina, além de genes de resistência a bacitracinas e tetraciclinas. A produção de esporos in vitro variou de 6,17 x 104 a 4,79 x 106 esporos/mL. As estirpes estocadas a 20°C mantiveram contagens ligeiramente mais elevadas ao longo do tempo, apresentando tempo de prateleira estimado de 23 meses. A estirpe NTCD foi capaz de prevenir ICD em todos os animais que a receberam, permanecendo no intestino até o último dia experimental.

The objectives of this study were to characterize five strains of non-toxigenic Clostridium difficile (NTCD), to assess the temporal viability of freeze-dried spores and prevent C. difficile infection (CDI) in hamsters using one NTCD strain. The tests performed were PCR and ELISA to confirm the toxigenic profile, in vitro spore production and evaluation of antimicrobial resistance profile. One strain was selected and lyophilized in several aliquots, which were kept at 4 and 20°C and subjected to three spore count methods monthly. A total of 107 spores of NTCD strain was administered to hamsters previously treated with clindamycin. The challenge with 108 spores from a toxigenic strain of C. difficile was performed 12 and 48 hours after administration of NTCD strain and the animals were observed for 28 days. Strains were confirmed as non-toxigenic, were resistant to clindamycin and lincomycin and presented resistance genes to bacitracins and tetracyclines. The production of spores in vitro ranged from 6.17 x 104 to 4.79 x 106 spore/ml. Strains stored at 20°C maintained slightly higher counts over time, with estimated shelf life of 23 months. NTCD strain was able to prevent ICD in all animals that received it and remaining in the intestine until the last experiment day.