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Tese em Português | VETTESES | ID: vtt-221325

Resumo

Streptococcus suis é um patógeno de grande importância na indústria suína sendo capaz de provocar diferentes quadros clínicos em animais de várias idades e, além disso, também é considerado um agente zoonótico. Dessa forma, é de extrema importância a caracterização das estirpes que causam doença em suínos no Brasil. Os objetivos deste estudo foram a caracterização fenotípica e genotípica de 215 estirpes de S. suis isoladas entre os anos de 2001 e 2016, de suínos com sinais clínicos de infecção, provenientes de diferentes Estados do Brasil. Para tanto, as estirpes isoladas neste período e mantidas a 86C foram reativadas e submetidas à confirmação da identificação por PCR e espectrometria de massa MALDI TOF. Em seguida, foi realizada sorotipagem molecular e a identificação de genes de virulência pela PCR, e a foi realizada a genotipagem pelas técnicas de AFLP e PFGE. Para a identificação dos perfis de resistência aos antimicrobianos foi utilizada a técnica de microdiluição em caldo, obtendo os valores de concentração inibitória mínima (CIM). A partir dos resultados fenotípicos e genotípicos foram selecionadas 24 estirpes para o sequenciamento do genoma utilizando a plataforma Illumina® MiSeq. O sorotipo mais frequentemente identificado foi o 2 / ½ (82,8%); seguido em menor proporção pelos sorotipos 3, 4, 6, 7, 8, 9, 18, 27, 28, 1 / 14, sendo apenas seis estirpes não tipaveis (NT). Para caracterização do perfil de virulência foram avaliados quatro genes sly, arcA, epf e as variantes de mrp sendo identificados 11 perfis de virulência nas estirpes estudadas. A genotipagem por AFLP identificou 30 perfis genotípicos e a técnica de PFGE identificou 64 pulsotipos. Para ambas as técnicas não foi identificada uma correlação clara entre dados epidemiológicos e genotípicos, mas pode se observar uma tendência de agrupamento das estirpes por ano de isolamento. A partir dos resultados de CIM foram identificados nove perfis de susceptibilidade aos antimicrobianos com 72,1% das estirpes classificadas como multirresistentes. Foram detectadas altas taxas de resistência às tetraciclinas, macrolídeos, clindamicina e sulfadimetoxina, enquanto beta--lactâmicos e florfenicol foram os antimicrobianos mais eficazes. A partir da análise genômica não foram detectados marcadores de plasmídeos e apenas três genes de resistência foram identificados nos genomas brasileiros; destaca--se o gene ermB, que codifica resistência à macrolídeos e lincosamidas, que foi detectado em 79,2% das estirpes estudadas. Foram identificadas oito novas sequências de alelos na MLST e uma nova combinação alélica, de tal forma que foram identificadas seis novas sequências tipo (STs) dentre os 24 genomas analisados. A partir do mapeamento das nove estirpes do sorotipo 2 foi identificado um elemento genético móvel (CMGETZ080501), relacionado à resistência aos antimicrobianos, em sete destas; as duas estirpes Brasileiras do sorotipo 2 que se diferenciam das demais (45 e 47) foram as mais sensíveis. Em relação às cinco estirpes do sorotipo 3, foi observado no mapeamento que duas destas se distanciam das demais e apresentam maior similaridade ao genoma da referência do sorotipo 4. Este resultado também foi verificado tanto na wgSNP quanto na análise da MLST, confirmando que a caraterização capsular de S. suis não deve ser utilizada como um indicativo de similaridade genética. Tendo em vista a variabilidade genética e a alta frequência de multirresistência identificada nas estirpes de S. suis circulantes no país, é possível avaliar as razões para que o controle do agente continue sendo um grande desafio para a suinocultura intensiva nacional.


Streptococcus suis is a pathogen of great importance in the pig industry and can cause diverse clinical conditions in animals of different ages, in addition of this, is also considered a zoonotic agent. Thus, is essential the characterization of strains that causes disease in swine from Brazil. The current study aimed phenotypic and genotypic characterization of 215 S.suis strains isolated between 2001 and 2016 from diseased swine of different Brazilian states. Isolated strains were stored at 86 ° C and were posteriorly reactivated for confirmation through PCR and MALDI TOF mass spectrometry. Subsequently, molecular serotyping and virulence gene identification were performed by PCR, and genotyping was performed by AFLP and PFGE techniques. To identify the resistant profiles, the minimum inhibitory concentration (MIC) was determined using the broth microdilution technique. Based on the results obtained from the phenotypic and genotypic characterization, twenty four strains were selected for genome sequencing using the Illumina® MiSeq platform. The most frequently identified serotype was 2 / ½ (82.8%); followed to a lesser extent by serotypes 3, 4, 6, 7, 8, 9, 18, 27, 28, 1/14, with only six non typeable strains (NT). For virulence profile characterization, four genes sly, arcA, epf and mrp variants were screened, and were identified 11 virulence profiles in the studied strains. The genotyping by AFLP technique identified 30 genotypic profiles and the PFGE technique identified 64 pulsotypes. For both techniques, no clear correlation between epidemiological and genotypic data could be identified, but a tendency to group strains per year of isolation can be observed. The MIC results identified nine antimicrobial susceptibility profiles and 72.1% of the strains were classified as multidrug resistant. High rates of resistance to tetracyclines, macrolides, clindamycin and sulfadimethoxine were observed, while beta lactams and florfenicol were the most effective antimicrobials. In the genomic analysis, no plasmid markers were detected and only three resistance genes were identified in the S. suis Brazilian genomes; the ermB gene, which encodes resistance to macrolides and lincosamides, was detected in 79.2% of the 24 studied genomes. The MLST analysis identified eight new allele sequences and one new allelic combination, such that six new type sequences (STs) were identified among the 24 genomes analyzed. It was identified a mobile genetic element (CMGETZ080501) related to antimicrobial resistance in seven from nine strains of serotype 2; the two Brazilian serotype 2 strains that differ from the others (45 and 47) were the most susceptible strains to antimicrobials. Regarding genetic mapping of the strains from serotype 3, it was observed that two of them differ from the others and show greater similarity to the reference genotype of serotype 4 strains. This result was both verified in wgSNP and MLST analysis, confirming that the capsular characterization of S. suis should not be used as an indication of genetic similarity. Given the genetic variability and the high frequency of multidrug resistance identified in the S. suis strains circulating in the country, it is possible to evaluate the reasons for the control of the agent to remain a major challenge for the national intensive pig production systems.

2.
Tese em Português | VETTESES | ID: vtt-204832

Resumo

Métodos microbiológicos tradicionais como isolamento, coloração de Gram e testes bioquímicos auxiliam na identificação do gênero Streptococcus, no entanto, as espécies apresentam ampla variação fenotípica, tornando difícil a identificação ou diferenciação das mesmas apenas por estes métodos. Uma das espécies mais importantes em suínos, Streptococcus suis, tem provocado grandes prejuízos em todo o mundo e tem sido descrito como uma importante zoonose em alguns países. S. suis está presente nas vias respiratórias superiores, colonizando principalmente tonsilas, cavidades oral e nasal facilitando a alta disseminação por contato direto, principalmente em leitões entre 4 e 12 semanas de vida. Os quadros clínicos mais frequentes em suínos infectados pelo S. suis são meningite, artrite e pneumonia. O objetivo do presente estudo foi identificar estirpes do gênero Streptococcus mediante as técnicas de reação em cadeia pela polimerase (PCR), sequenciamento parcial do gene 16S rRNA e espectrometria de massa MALDI-TOF (MALDI-TOF MS). As análises por PCR e por MALDI-TOF MS resultaram na identificação de 215 estirpes como S. suis e 35 como diferentes espécies pertencentes ao gênero Streptococcus. Os resultados da identificação das 35 estirpes pertencentes a outras espécies do gênero Streptococcus pelo MALDI-TOF MS foram confirmados pelo sequenciamento parcial do gene 16S rRNA, sendo que as duas técnicas apresentaram 100% de concordância. Os resultados obtidos indicam grande eficácia na utilização das técnicas avaliadas para a identificação de S suis e de outras espécies do gênero Streptococcus. A técnica de MALDI-TOF MS, apesar do custo elevado do equipamento, apresentou a vantagem de ser rápida, apresentar baixo custo por análise e reduzida utilização de material.


Traditional microbiological methods such as isolation, Gram staining and biochemical tests help to identify the Streptococcus genus, however, the species present broad phenotypic variation, making it difficult for their identification or even differentiation just by these methods. One of the most important species in swine, Streptococcus suis, has led to great losses worldwide and has been described as an important zoonosis in some countries. S. suis is present in the upper airways, especially colonizing tonsils, oral and nasal cavities facilitating the high dissemination by direct contact, especially among piglets between 4 to 12 weeks of age. The most common clinical manifestations in pigs infected by S. suis are meningitis, arthritis and pneumonia. The aim of this study was to identify Streptococcus strains by polymerase chain reaction (PCR), 16S rRNA gene partial sequencing and MALDI-TOF mass spectrometry (MALDI-TOF MS). PCR and MALDI-TOF MS analysis resulted in the identification of 215 strains as S. suis and 35 as different species of the Streptococcus genus. The identification of the 35 strains belonging to other species of the genus by MALDI-TOF MS was confirmed by 16S rRNA gene partial sequencing, and both techniques presented 100% concordance. These results demonstrate the high efficiency in the use of the evaluated techniques for the identification of S. suis and the other species of the Streptococcus genus. The MALDI-TOF MS technique, despite the equipment high cost, presented the advantage of being fast, have low cost per analysis and reduced material usage.

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