Lentivirus vectors fail to deliver transgenes into bovine zygotes after co-incubation with sperm during in vitro fertilization / [Lentivírus falham na entrega de transgenes em zigotos bovinos após coincubação com espermatozoide, durante fertilização in vitro]

As vantagens dos animais transgênicos têm sido demonstradas em diferentes aplicações, entretanto muitas metodologias usadas para gerar animais geneticamente modificados (GM) apresentam baixas taxas de eficiência. O objetivo deste estudo foi avaliar a entrega dos vetores lentivirais (VLs) em zigotos durante a fertilização in vitro (FIV), para gerar embriões GM, com o gene da proteína verde fluorescente (GFP) ou do fator IX de coagulação humana (FIX). Vetores lentivirais com os genes GFP (pLGW-GFP-LV) ou FIX (pLWE2-FIX-LV) foram utilizados na FIV ou na cultura de embriões in vitro (CIV). A coincubação de pLWE2-FIX-LV com espermatozoides e complexos oócitos-células do cumulus (COCs) durante a FIV diminuiu (P<0,05) as taxas de clivagem e de blastocistos, enquanto com pLGW-GFP-LV diminuiu (P<0,05) a taxa de blastocisto quando se comparou ao controle sem VL. A coincubação de pLWE2-FIX-LV e pLGW-GFP-LV com presumíveis zigotos durante a CIV não afetou (P>0,05) o desenvolvimento embrionário. A expressão da proteína GFP não foi detectada em embriões após a coincubação de FIV ou CIV, embora as células do cumulus expressassem a proteína até o dia oito de cultivo in vitro. Reações em cadeia da polimerase (PCR) não detectaram os genes GFP ou FIX em embriões, mas ambos foram detectados em células do cumulus. Assim, a coincubação de VL com espermatozoide bovino e COCs não é eficaz para produzir embriões geneticamente modificados por meio de FIV.(AU)

Quantificação do DNA e genotipagem de biópsias de embriões bovinos Gir e Girolando produzidos in vitro / DNA quantification and genotyping of biopsies obtained from Gyr and Girolando in vitro produced bovine embryos

A biópsia embrionária associada à genotipagem permite a obtenção de informações genômicas antes mesmo da transferência dos embriões. Neste estudo, foram avaliadas amostras biopsiadas de blastocistos bovinos transferidos para receptoras (n=47), sob a hipótese de que a raça (Gir ou Girolando), o estádio embrionário (blastocisto ou blastocisto expandido) e a competência para estabelecimento de prenhez (positiva ou negativa) afetariam a quantidade e a qualidade do DNA da amostra obtida. O DNA foi extraído, amplificado, quantificado por eletroferograma e genotipado. O parâmetro call rate (CR) foi adotado para mensurar a qualidade da genotipagem. Obteve-se concentração de DNA de 86,07±171,66ng/µL e CR 0,73±0,17. O CR não variou em função da quantidade de DNA nas amostras. As variáveis raça e estádio embrionário não influenciaram a concentração de DNA, nem o CR. Houve efeito da prenhez sobre o CR (P=0,0187), mas, como houve maior CR nas amostras provenientes do grupo prenhez negativa, não foi possível associar esse parâmetro à qualidade embrionária. Concluiu-se que a raça e a qualidade embrionária não afetam os parâmetros aqui estudados em amostras embrionárias, ou seja, embriões com maiores chances de implantação não refletem alta qualidade nas amostras de biópsia genotipadas.(AU)

Embryo biopsy associated with genotyping allows genomic information before embryo transfer. In this study, blastocyst biopsy samples from embryos transferred to recipients (n= 47) were evaluated, under the hypothesis that breed (Gyr or Girolando), embryonic stage (blastocyst or expanded blastocyst) and competence to establish pregnancy (positive or negative) would affect the quantity and DNA quality of samples. DNA was extracted, amplified, quantified by electropherogram and genotyped. The parameter call rate (CR) was used to measure the quality of genotyping. DNA concentration of 86.07±171.66ng/µl, and CR 0.73±0.17 was obtained. CR did not vary according to the amount of DNA in the samples. The variables breed and embryonic stage had no influence on DNA concentration or CR. There was pregnancy effect on the CR (P= 0.0187), but since there was a higher CR in the samples from the negative pregnancy group, it was not possible to associate this parameter with the embryonic quality. We conclude that the breed and embryo quality do not affect the evaluated parameters in embryonic samples. Embryos with higher chances of implantation do not reflect high quality in embryo biopsy genotyped samples.(AU)

Quantificação do DNA e genotipagem de biópsias de embriões bovinos Gir e Girolando produzidos in vitro / DNA quantification and genotyping of biopsies obtained from Gyr and Girolando in vitro produced bovine embryos

A biópsia embrionária associada à genotipagem permite a obtenção de informações genômicas antes mesmo da transferência dos embriões. Neste estudo, foram avaliadas amostras biopsiadas de blastocistos bovinos transferidos para receptoras (n=47), sob a hipótese de que a raça (Gir ou Girolando), o estádio embrionário (blastocisto ou blastocisto expandido) e a competência para estabelecimento de prenhez (positiva ou negativa) afetariam a quantidade e a qualidade do DNA da amostra obtida. O DNA foi extraído, amplificado, quantificado por eletroferograma e genotipado. O parâmetro call rate (CR) foi adotado para mensurar a qualidade da genotipagem. Obteve-se concentração de DNA de 86,07±171,66ng/µL e CR 0,73±0,17. O CR não variou em função da quantidade de DNA nas amostras. As variáveis raça e estádio embrionário não influenciaram a concentração de DNA, nem o CR. Houve efeito da prenhez sobre o CR (P=0,0187), mas, como houve maior CR nas amostras provenientes do grupo prenhez negativa, não foi possível associar esse parâmetro à qualidade embrionária. Concluiu-se que a raça e a qualidade embrionária não afetam os parâmetros aqui estudados em amostras embrionárias, ou seja, embriões com maiores chances de implantação não refletem alta qualidade nas amostras de biópsia genotipadas.(AU)

Embryo biopsy associated with genotyping allows genomic information before embryo transfer. In this study, blastocyst biopsy samples from embryos transferred to recipients (n= 47) were evaluated, under the hypothesis that breed (Gyr or Girolando), embryonic stage (blastocyst or expanded blastocyst) and competence to establish pregnancy (positive or negative) would affect the quantity and DNA quality of samples. DNA was extracted, amplified, quantified by electropherogram and genotyped. The parameter call rate (CR) was used to measure the quality of genotyping. DNA concentration of 86.07±171.66ng/µl, and CR 0.73±0.17 was obtained. CR did not vary according to the amount of DNA in the samples. The variables breed and embryonic stage had no influence on DNA concentration or CR. There was pregnancy effect on the CR (P= 0.0187), but since there was a higher CR in the samples from the negative pregnancy group, it was not possible to associate this parameter with the embryonic quality. We conclude that the breed and embryo quality do not affect the evaluated parameters in embryonic samples. Embryos with higher chances of implantation do not reflect high quality in embryo biopsy genotyped samples.(AU)

Doppler ultrasonography as a tool for ovarian management

Doppler ultrasonography allows the characterization and measurement of blood flow, and can be used to indirectly make inference regarding the functionality of different organs, including the ovaries. Several studies highlighted the importance of an adequate blood flow for follicle development and acquisition of ovulatory potential, and for progesterone secretion by the corpus luteum. Due to some particularities of the ovarian vascular anatomy, however, different strategies had to be developed to measure the blood flow detected by Doppler imaging. Some of these approaches were successful to characterize the patterns of blood flow throughout the estrous cycle, pregnancy, and early postpartum, but require post acquisition image processing and do not allow real time decisions to be taken. The subjective evaluation of blood flow has been alternatively used in field conditions aiming to early detect non pregnant animals, select embryo recipients, or predict artificial insemination and in vitro fertilization outcomes. In summary, color Doppler imaging provides important information about the function of corpus luteum and follicles, supporting clinical diagnoses and management decisions. Nonetheless, the adoption of Doppler ultrasonography as a routine exam, instead of a limited use in an individual basis, requires further development of feasible blood flow evaluation procedures and the establishment of reference values.

Doppler ultrasonography as a tool for ovarian management

Doppler ultrasonography allows the characterization and measurement of blood flow, and can be used to indirectly make inference regarding the functionality of different organs, including the ovaries. Several studies highlighted the importance of an adequate blood flow for follicle development and acquisition of ovulatory potential, and for progesterone secretion by the corpus luteum. Due to some particularities of the ovarian vascular anatomy, however, different strategies had to be developed to measure the blood flow detected by Doppler imaging. Some of these approaches were successful to characterize the patterns of blood flow throughout the estrous cycle, pregnancy, and early postpartum, but require post acquisition image processing and do not allow real time decisions to be taken. The subjective evaluation of blood flow has been alternatively used in field conditions aiming to early detect non pregnant animals, select embryo recipients, or predict artificial insemination and in vitro fertilization outcomes. In summary, color Doppler imaging provides important information about the function of corpus luteum and follicles, supporting clinical diagnoses and management decisions. Nonetheless, the adoption of Doppler ultrasonography as a routine exam, instead of a limited use in an individual basis, requires further development of feasible blood flow evaluation procedures and the establishment of reference values.(AU)

Features and perspectives of the Brazilian in vitro embryo industry

In the last decade , in vitro fertilization emerged as an alternative to superovulation and has become the technique of choice for bovine embryo production, especially in zebu breeds. The recent growth in the commercial use of in vitro technologies in the Brazilian embryo industry is reviewed here in , highlighting the features and trends during different periods , as well as future challenges and perspectives . The data presented here w ere provided by the Statistics Committee of the Brazilian Embryo Techno logy Society and include reports from breeders associations, commercial IVF companies and ET practitioners . Three different periods were characterized for the use of IVF technologies in the Brazilian embryo industry: 1) the early years (1999 - 2003), when IV F growth was driven by the growing demand from the embryo market, although the technology was still labeled as elit ist ; 2) a period of exponential growth (2003 - 2006), when IVF overc a me conventional ET as the technique of choice for embryo production; and 3 ) a later period , when total numbers tend ed to stabilize but IVF started to increase in importance in dairy breeds. The whole picture shows IVF as an interesting example of innovation, since the development of these new embryo technologies provided new pro ducts, processes and possibilities to satisfy demands and remarkably change the scenario of the Brazilian embryo industry.

Features and perspectives of the Brazilian in vitro embryo industry

In the last decade , in vitro fertilization emerged as an alternative to superovulation and has become the technique of choice for bovine embryo production, especially in zebu breeds. The recent growth in the commercial use of in vitro technologies in the Brazilian embryo industry is reviewed here in , highlighting the features and trends during different periods , as well as future challenges and perspectives . The data presented here w ere provided by the Statistics Committee of the Brazilian Embryo Techno logy Society and include reports from breeders associations, commercial IVF companies and ET practitioners . Three different periods were characterized for the use of IVF technologies in the Brazilian embryo industry: 1) the early years (1999 - 2003), when IV F growth was driven by the growing demand from the embryo market, although the technology was still labeled as elit ist ; 2) a period of exponential growth (2003 - 2006), when IVF overc a me conventional ET as the technique of choice for embryo production; and 3 ) a later period , when total numbers tend ed to stabilize but IVF started to increase in importance in dairy breeds. The whole picture shows IVF as an interesting example of innovation, since the development of these new embryo technologies provided new pro ducts, processes and possibilities to satisfy demands and remarkably change the scenario of the Brazilian embryo industry.(AU)

Quantificação de transcritos maternos em oócitos bovinos submetidos a diferentes condições de maturação / Quantification of maternal transcripts in bovine oocytes under different maturation systems

Comparou-se a quantidade relativa de transcritos de origem materna entre oócitos bovinos maturados in vivo e maturados em diferentes condições in vitro. Avaliou-se também o efeito dos sistemas de maturação in vitro sobre a viabilidade das células do cumulus. Para a maturação in vivo, os oócitos foram coletados 19-20h após aplicação de gonadorelina em doadoras superestimuladas com FSH e sincronizadas com implante de progesterona. Para a maturação in vitro, oócitos imaturos, obtidos de ovários coletados em matadouro, foram maturados sob diferentes tensões de oxigênio e suplementação proteica. Avaliou-se a abundância dos transcritos de Zar1, MATER e GDF9 por PCR em tempo real. A viabilidade das células do cumulus de oócitos maturados in vitro foi analisada pela coloração de Azul de Tripan. Observou-se sub-regulação (P<0,05) dos transcritos em oócitos submetidos às diferentes condições de maturação in vitro em relação aos maturados in vivo. Não houve diferença (P>0,05) na viabilidade das células do cumulus. Conclui-se que o sistema de maturação influencia a quantidade de transcritos de origem materna armazenados no citoplasma de oócitos bovinos.(AU)

The relative abundance of maternal transcripts among bovine oocytes in vivo matured or under different in vitro conditions was compared. Viability of cumulus cells of in vitro matured oocytes was also evaluated. For in vivo maturation, oocytes were recovered from 19 to 20h after gonadorelin injection in donor cows, which were previously superestimulated with FSH and synchronized with progesterone implant. For in vitro maturation, immature cumulus-oocyte complexes, obtained from ovaries collected at slaughterhouse, were matured under different oxygen tensions and protein supplementation. Relative amount of Zar1, MATER, and GDF9 transcrispts were analyzed by real time PCR. Cumulus cell viability was analyzed by trypan blue. The expression of maternal effect genes were down-regulated (P<0.05) in oocytes matured under different in vitro conditions when compared to those in vivo matured. There was no difference (P>0.05) on cumulus cell viability among different in vitro maturation conditions. In conclusion, different maturation conditions affect the relative abundance of maternal transcripts stored into oocyte cytoplasm.(AU)

Efeito do citrato e taurina em meio CR2aa no desenvolvimento de embriões bovinos fecundados in vitro / Effect of citrate and taurine added to CR2aa medium on the development of in vitro-fertilized bovine embryos

Avaliou-se o efeito do citrato em meio CR2aa suplementado com soro fetal bovino (SFB) ou livre de proteínas séricas e sua associação com taurina no desenvolvimento de embriões bovinos fecundados in vitro. Embriões foram cultivados em CR2aa contendo 0, 0,5, 1,0 e 3,0mM citrato, suplementado com 10 por cento SFB (experimento 1) ou com álcool polivinil (PVA; experimento 2). No terceiro experimento, embriões foram cultivados em meio com 0,5mM citrato, ou 7mM taurina, ou com a associação de ambos, suplementado com SFB. Os cultivos foram realizados com células do cumulus em ambiente a 38,8ºC com 5 por cento de CO2 em ar atmosférico. Melhora no desenvolvimento embrionário foi observado no cultivo de embriões em CR2aa com 0,5 e 1,0mM citrato na ausência de SFB (P<0,05), 8,6 por cento e 11,3 por cento de blastocistos, respectivamente, porém com valores mais baixos (P<0,05) que embriões cultivados em CR2aa com SFB (31,9 por cento). Associação de citrato com taurina em meio com SFB não influenciou (P>0,05) a produção de embriões ou o número de células. Citrato em meio CR2aa pode ser uma alternativa para cultivo embrionário em condições atmosféricas com 5 por cento de CO2 em ar na ausência de proteína sérica.(AU)

The effect of citrate added to CR2aa medium supplemented with fetal calf serum (FCS) or serum-proteinfree and its association with taurine on the development of in vitro-fertilized bovine embryos was evaluated. Embryos were cultured with 0, 0.5, 1.0, and 3.0mM citrate, in CR2aa supplemented with 10 percent FCS (experiment 1), or polyvinyl alcohol (PVA; experiment 2). In experiment 3, embryos were cultured with 0.5mM citrate, 7.0mM taurine or with association of both, in medium supplemented with FCS. Embryo culture was performed with cumulus cells at 38.8ºC in 5 percent CO2 under air for all experiments. Positive effect on embryo development was only observed with 0.5 and 1.0mM citrate in FCS-free CR2aa (P<0.05; 8.6 percent and 11.3 percent blastocyst, respectively), however with lower embryo rate than CR2aa with FCS (31.9 percent). Association between citrate and taurine in medium supplemented with FCS did not affect (P>0.05) embryo rate nor total cell number. Citrate in CR2aa medium can be an alternative for serumfree embryo culture under 5 percent CO2 in air, absence of serum protein.(AU)

Concentração espermática e tempo de incubação na fecundação in vitro usando-se sêmen de touros da raça Guzerá / Sperm concentration and incubation period on in vitro fecundation using sperm of Guzera bulls

Estudou-se o efeito da concentração espermática e período de incubação e da interação dessas características sobre a fecundação in vitro (FIV) usando-se sêmen de touros Guzerá. Oócitos (n=1146) maturados in vitro foram divididos em tratamentos objetivando a FIV, em esquema fatorial 3×2×2 (três touros - A, B e C, duas concentrações espermáticas - 2 e 4×106 espermatozóides/ml e dois tempos de incubação 12 e 18 horas). Utilizaram-se espermatozóides viáveis obtidos por swin-up. A FIV foi realizada em meio fert-talp com heparina, em incubadora com 5% de CO2 e 95% de umidade, a 38,5°C. Após incubação, 50% dos oócitos foram fixados e corados para determinação das taxas de penetração, fecundação monoespermática e poliespermia. O restante foi co-cultivado com células da granulosa em meio CR2aa por oito dias, avaliando-se a taxa de clivagem e a produção de blastocisto. Houve maior taxa de penetração (P<0,05) na concentração de 4×106 espermatozóides/ml por 18 horas (64%), e não se observou diferença (P>0,05) entre os demais tratamentos. A taxa de poliespermia foi maior (P<0,05) na concentração espermática de 4×106, independente do tempo de incubação. Na concentração espermática mais alta, a taxa de poliespermia foi maior no tempo de incubação de 18 horas (P<0,05). O touro A apresentou menor (P<0,05) taxa de poliespermia em relação aos demais. Ainda, no touro A a taxa de clivagem foi maior (P<0,05) que no touro B, enquanto o C mostrou-se semelhante tanto ao A quanto ao B. O tempo de incubação, a concentração espermática e a interação das variáveis influenciaram as taxas de penetração e poliespermia, sem interferir na taxa de fecundação monoespermática e na produção de blastocistos.(AU)

The effects of sperm concentration, incubation period and their interaction on in vitro fertilization (IVF) using sperm of Guzera bulls were evaluated. In vitro matured oocytes (n=1146) were allotted to IVF treatments in a factorial scheme 3×2×2 - three bulls (A, B and C), two sperm concentrations (2 and 4×106 spermatozoa/ml) and two incubation periods (12 and 18h). Viable spermatozoa were obtained by swim-up. The IVF was performed using in Fert-Talp medium with heparin, on incubator with 5% CO2 and 95% humidity, at 38.5ºC. After the incubation, 50% of oocytes were fixed and stained to determine penetration, monospermic fecundation and polyspermy rates. The remainder was co-cultured with granulosa cells in CR2 medium for eight days to evaluate cleavage and embryo production rates. The penetration rate was higher (P<0.05) for sperm concentration of 4×106 spermatozoa/ml incubated for 18 hours (64%), and no differences (P>0.05) among remainder treatments were observed. The polyspermic rate (P<0.05) was higher for higher sperm concentration and incubation period. Bull A showed the lowest (P<0.05) polyspermy rate. Bulls A and C showed higher (P<0.05) cleavage than bull B. Incubation period, sperm concentration, and interaction of these two factors influenced penetration and polyspermy rates, without any effect on monospermic fecundation rates and embryos production.(AU)

Protocolos de produção in vitro de embriões na raça Gir / In vitro embryo production protocols in Gir breed

Avaliaram-se os efeitos de dois protocolos de punção folicular na quantidade/qualidade dos oócitos e na produção in vitro de embriões, em vacas da raça Gir, não-lactantes. O ciclo estral foi sincronizado com cloprostenol e ao longo do experimento os animais receberam implantes auriculares de norgestomet, renovados a cada 14 dias. Os animais foram submetidos aos protocolos I (sem estimulação hormonal, com punção folicular duas vezes/semana) e II (pré-tratamento com 250 UI de FSH em doses decrescentes, três dias antes da punção folicular). Os oócitos recuperados foram levados ao laboratório em meio TALP-Hepes e submetidos à maturação. Na fecundação in vitro utilizou-se sêmen de touro Gir, previamente capacitado. Após 22 horas de fecundação, os prováveis zigotos foram co-cultivados com células da granulosa em CR2aa acrescido de 10% de soro fetal bovino. A taxa de clivagem foi avaliada 72 horas pós-fecundação e a de blastocisto 192 horas pós-fecundação. O número total de folículos foi maior (P<0,05) no protocolo II, assim como o número de folículos grandes e médios (P<0,05) e o diâmetro do maior folículo (P<0,05), sendo o número de folículos pequenos (P<0,05) menor. O total de oócitos recuperados por sessão não foi diferente entre os protocolos I e II (P>0,05). O número de oócitos de grau I e a taxa de clivagem foram maiores (P<0,05) e o número de degenerados menor protocolo II. A pré-estimulação ovariana com FSH pode melhorar a qualidade e a taxa de clivagem dos oócitos recuperados por punção folicular em animais Gir.(AU)

The effect of two ovum pick-up protocols on amount/quality of oocytes retrived and on in vitro embryo production of Gyr cows was evaluated in non-lactating cycling cows with good body and reproductive conditions. Estrous cycles were synchronized with cloprostenol. During the experiment, animals received norgestomet ear implants, replaced every 14 days. Animals were submitted to protocol I (without hormonal estimulation) and protocol II (pre-stimulation with 250 IU of FSH three days before aspiration). Recovered oocytes were transported in Talp-Hepes to the laboratory, classified and maturated. Twenty two hours after fertilization, presumptive zygotes were co-culture with granulosa cells in CR2aa supplemented with 10% of fetal calf serum. Cleavage rate was assessed at 72 hours post-fertilization, and blastocyst production 192 hours post-fertilization. The total number of follicles, the number of large and medium follicles and the diameter of the largest follicle were higher (P<0.05) in protocol II, and the number of small follicles (P<0.05) was lower than in protocol I. No difference between protocols I and II was observed for oocytes recovered per aspiration section (P>0.05). The number of grade I oocytes and cleavage rate were higher (P<0.05) in protocol II and the number of degenerated oocytes was lower (P<0.05). The pre-stimulation with FSH can improve the quality and cleavage rate of oocytes recovered by ovum pick-up in zebu animals.(AU)

Características andrológicas de touros da raça Gir / Andrological characteristics of Gyr (bos indicus) bulls

Determinaram-se as características andrológicas de touros da raça Gir, classificando-os quanto ao seu potencial reprodutivo, utilizando-se o sistema de classificação andrológica por pontos (CAP). Os animais foram separados em três grupos: G1= animais de 18-24 meses (n=33), G2 = 25-31 meses (n=24) e G3 = 32-38 meses (n=12). A média da circunferência escrotal no G1 foi menor (P<0,05) do que nos G2 e G3. A motilidade (%) e o vigor não diferiram entre os grupos. As taxas (%) de defeitos maiores e totais foram maiores (P<0,05) no G1 do que nos G2 e G3. Para as características andrológicas não houve diferenças entre G2 e G3. Com relação ao CAP, G1, G2 e G3 apresentaram, respectivamente, 25,7%, 58,3% e 61,5% de animais aptos à reprodução; 11,4%, 20,8% e 15,4% questionáveis e 57,1%, 12,5% e 15,4% inaptos ou imaturos. A idade dos touros Gir influenciou a circunferência escrotal e os defeitos maiores e totais, mas não a motilidade e o vigor. Maior proporção de animais aptos à reprodução ocorreu após 24 meses de idade.(AU)

Gyr bulls were ranked regarding their reproductive potential, following evaluations through the score-based andrological classification system (ACP). For the examinations, three animal age groups were considered: 18 to 24 month-old (G1, n=33), 25 to 31 month-old (G2, n=24), and 32 to 38 month-old (G3, n=12). Scrotal circumference was lower in G1, as compared to G2 and G3 (P<0.05). Percent motility and vigor were not affected by the age groups. Percent rates of major and total defects were higher (P<0.05) in G1 than in G2 or G3. No significant differences were observed when G2 and G3 were compared. Regarding ACP data, G1, G2 and G3 yielded, respectively, 25.7, 58.3 and 61.5% of adequate breeders; 11.4, 20.8 and 15.4% of bulls with undefined breeding capacity, and 57.1, 12.5 and 15.4% of inapt breeders or immature animals. Age group affected scrotal circumference and major and total defects, but did not influence motility or vigor. The highest proportion of adequate breeders was obtained with 24-month-old bulls and older.(AU)

Avaliação da capacitação espermática in vitro pela reação acrossômica e viabilidade, em sêmen de touros Guzerá

O objetivo deste trabalho foi avaliar a capacitação espermática pela reação acrossômica e viabilidade espermática de sêmende touros Guzerá. Utilizou-se sêmen de diferentes touros adquiridos de centrais de inseminação artificial. Após o descongelamento,o sêmen foi incubado inicialmente com 0 (T1) e 10 mg/ml (T2) de heparina por quatro horas a 39ºC e 95% deumidade, e posteriormente com lisofosfatidilcolina por mais 15 minutos, para indução da reação acrossômica. Antes e apóso período de incubação foram feitas lâminas para a análise da viabilidade espermática e reação acrossômica. Verificou-seque o tratamento com heparina aumentou a taxa de espermatozóides com reação acrossômica (p 0,05), e que houve diferençasna fertilidade entre os touros após a capacitação espermática. Conclui-se que o teste de reação acrossômica e viabilidadeespermática pode ser utilizado para avaliação da capacitação espermática in vitro de touros da raça Guzerá.

Secreção de interferon-tau em embriões bovinos produzidos in vitro frescos e congelados / Interferon tau secretion in cattle embryos in vitro fertilized before and after cryopreservation

Avaliou-se a interferência da criopreservação sobre a secreção de interferon-tau (IFN-t) por embriões bovinos produzidos in vitro. Usaram-se dois grupos de tratamentos: I) constituído por embriões não criopreservados (fresco) e II) embriões criopreservados. Os embriões, após atingirem a fase de blastocisto (fresco ou imediatamente após o descongelamento dos criopreservados), continuaram a ser cultivados individualmente por mais sete dias. Do meio de cultivo em que se mantiveram os blastocistos retiraram-se alíquotas com três e sete dias do início do cultivo, para a avaliação da secreção de IFN-t pelos embriões cultivados. Os embriões congelados secretaram menos IFN-t do que aqueles não criopreservados (P<0,05), e com sete dias houve maior secreção do interferon do que com três dias (P<0,05). A criopreservação prejudicou a produção de IFN-t pelo trofoblasto e pode comprometer o reconhecimento materno da gestação e o desenvolvimento do embrião pós-descongelamento.

The effect of cryopreservation in IFN-tau, from bovine embryos produced in vitro was evaluated. Two treated groups (G1= fresh bovine embryos, n=59 and G2= freezed embryos, n=84) were used to study the effect of cryopreservation on IFN-tau secretion. After reaching the blastocyst phase, the embryos were kept on individual culture for additional period of 7 days. On days 3 and 7 after the beginning of embryos cultivation, samples of the media culture were taken for IFN-tau secretion titration. Oocysts taken from follicles ranging from 3 to 5mm in diameter were obtained from ovaries of females at slaughterhouse. The embryos were frozen, after being dehydrated with ethylene glycol (1.8m), conditioned on 0.5ml palletes and frozen. Frozen embryos secreted lower IFN-tau than fresh embryos (P<0.05). At day 7 it was registered higher IFN-tau secretion from trophoblast than at day 3 (P<0.05). The increasing of IFN-tau secretion was observed when the blastocyst began to longed and it was directly related to the embryos development. The synthesis of IFN-tau is related to the capability of development of the blastocyst. Cryopreservation is a method that affects the maternal recognition of pregnancy and the post-freezing embryo development.

Secreção de interferon-tau em embriões bovinos produzidos in vitro frescos e congelados / Interferon tau secretion in cattle embryos in vitro fertilized before and after cryopreservation

Avaliou-se a interferência da criopreservação sobre a secreção de interferon-tau (IFN-t) por embriões bovinos produzidos in vitro. Usaram-se dois grupos de tratamentos: I) constituído por embriões não criopreservados (fresco) e II) embriões criopreservados. Os embriões, após atingirem a fase de blastocisto (fresco ou imediatamente após o descongelamento dos criopreservados), continuaram a ser cultivados individualmente por mais sete dias. Do meio de cultivo em que se mantiveram os blastocistos retiraram-se alíquotas com três e sete dias do início do cultivo, para a avaliação da secreção de IFN-t pelos embriões cultivados. Os embriões congelados secretaram menos IFN-t do que aqueles não criopreservados (P<0,05), e com sete dias houve maior secreção do interferon do que com três dias (P<0,05). A criopreservação prejudicou a produção de IFN-t pelo trofoblasto e pode comprometer o reconhecimento materno da gestação e o desenvolvimento do embrião pós-descongelamento.(AU)

The effect of cryopreservation in IFN-tau, from bovine embryos produced in vitro was evaluated. Two treated groups (G1= fresh bovine embryos, n=59 and G2= freezed embryos, n=84) were used to study the effect of cryopreservation on IFN-tau secretion. After reaching the blastocyst phase, the embryos were kept on individual culture for additional period of 7 days. On days 3 and 7 after the beginning of embryos cultivation, samples of the media culture were taken for IFN-tau secretion titration. Oocysts taken from follicles ranging from 3 to 5mm in diameter were obtained from ovaries of females at slaughterhouse. The embryos were frozen, after being dehydrated with ethylene glycol (1.8m), conditioned on 0.5ml palletes and frozen. Frozen embryos secreted lower IFN-tau than fresh embryos (P<0.05). At day 7 it was registered higher IFN-tau secretion from trophoblast than at day 3 (P<0.05). The increasing of IFN-tau secretion was observed when the blastocyst began to longed and it was directly related to the embryos development. The synthesis of IFN-tau is related to the capability of development of the blastocyst. Cryopreservation is a method that affects the maternal recognition of pregnancy and the post-freezing embryo development.(AU)

Efeito de diferentes meios de cultivo no desenvolvimento e proporção do sexo de embriões bovinos produzidos in vitro / Effect of different culture media on development and sex ratio of bovine embryos fertilized in vitro

Avaliou-se o efeito da suplementação de meios de cultivo sobre o desenvolvimento e proporção do sexo de embriões bovinos fertilizados in vitro. Complexos cumulus-oócitos obtidos de ovários de matadouro foram maturados e fertilizados in vitro. Os zigotos (n= 484) foram distribuídos aleatoriamente em meio CR2aa, contendo soro fetal bovino (SFB) (T1), albumina sérica bovina (BSA) (T2) ou BSA mais insulina:transferrina:selênio e vitaminas (BSA+) (T3), no cultivo embrionário in vitro, a uma atmosfera de 5% CO2 a 38,8ºC em ar. A taxa de clivagem foi observada 72-76 horas pós-fertilização (PF) e a taxa de blastocistos com sete e oito dias PF. Os blastocistos (n= 63) foram sexados pela técnica de reação em cadeia de polimerase. A taxa de clivagem em T2 foi maior (P<0,05) do que em T1 e T3. A taxa de blastocistos foi similar (P>0,05) entre T2 e T3, porém menor (P<0,01) do que em T1. A proporção do sexo dos embriões não diferiu (P>0,05) entre os tratamentos. O T1 influenciou o desenvolvimento de blastocistos, mas não teve efeito sobre a proporção do sexo.(AU)

The effect of culture media on the development and on the sex ratio of bovine embryos fertilized in vitro was studied. Cumulus oocyte-complexes from slaughterhouse ovaries were matured and fertilized in vitro. Zygotes (n= 484) were randomly allotted to different culture media and cultured with their cumulus cells in CR2aa medium and an atmosphere of 5% CO2 in air at 38.8ºC. The fetal calf serum (FCS), bovine seric albumin (BSA) or BSA plus insulin:transferrin:selenium and vitamins (BSA+) supplementation effect on embryo culture was evaluated. Cleavage rate was assessed at 72-76h post-fertilization (PF) and blastocyst rate on days 7 and 8 PF. The blastocysts (n= 63) were also sexed using polymerase chain reaction. Cleavage rate for BSA medium supplemented was higher (P<0.05) than FCS and BSA+. Blastocyst rates for BSA and BSA+ media were similar (P>0.05), but lower (P<0.01) than FCS. Culture medium FCS supplemented affected blastocyst development but not the sex ratio.(AU)

Características morfológicas e funcionais do corpo lúteo durante o ciclo estral em vacas da raça Gir

Luteal development, function and regression were studied in Gir cattle. Morphologic characteristics of corpora lutea were evaluated during the estrous cycle (n=15), using a portable ultrasound device. Luteal activity was evaluated by serum progesterone. The corpus luteum was first identified at 3.28±0.19 days after ovulation. There was a day effect on corpus luteum cross-section area (P 0.0001), on luteal tissue cross-section area (P 0.0001) and on progesterone levels (P 0.0001). Maximum corpus luteum cross-section area occurred between days 7 and 16 of the estrous cycle. During this period, mean corpus luteum area was 3.21±0.05cm², mean luteal cavity area was 0.42±0.04cm², luteal tissue was 3.06±0.05cm², and mean progesterone concentration was 4.61±0.17ng/ml. Luteal growth rate between first detection and day 7 was 0.42±0.05cm²/day, and regression rate between days 16 and 21 was -0.36±0.04cm²/day. Corpora lutea characteristics in Gir cattle were similar to those observed in other cattle breeds.

Estudaram-se o desenvolvimento, a função e a regressão luteal em vacas da raça Gir. As características morfológicas do corpo lúteo foram avaliadas ao longo de um ciclo estral completo (n=15), utilizando-se um aparelho portátil de ultra-som. A atividade luteal foi monitorada pela concentração plasmática de progesterona. O corpo lúteo foi inicialmente identificado aos 3,28±0,19 dias após a ovulação. Observou-se efeito significativo do dia do ciclo sobre a área da seção transversal do corpo lúteo (P 0,0001), do tecido luteal (P 0,0001) e sobre a concentração de progesterona (P 0,0001). A área média do corpo lúteo entre os dias 7 e 16 do ciclo foi de 3,21±0,05cm², das cavidades luteais 0,42±0,04cm², do tecido luteal 3,06±0,05cm², e a concentração média de progesterona foi de 4,61±0,17ng/ml. A taxa de crescimento luteal entre a primeira detecção e o dia 7 do ciclo foi de 0,42 FONT FACE="Symbol">5 /FONT>0,05cm²/dia, e a taxa de regressão entre os dias 16 e 21 foi de -0,36±0,04cm²/dia. As características morfológicas e funcionais do corpo lúteo de vacas da raça Gir são semelhantes àquelas observadas em outras raças bovinas.

Regressão luteal e dinâmica folicular após luteólise natural ou induzida por cloprostenol em vacas da raça Gir

The luteal regression and the follicular dynamic were evaluated during the natural luteal regression period (n=14) or after induction of luteolysis by the administration of 500 g of cloprostenol (n=13), using a portable ultrasound device. Luteolysis induction increased luteal regression over 24 (0.89±0.13×0.24±0.17cm²/day; P 0.05) and 48 hours period (0.78±0.15×0.36±0.07cm²/day; P 0.05), but the reduction of progesterone concentration was similar (P>0.05). There was no difference (P>0.05) in follicular dynamic between the two groups. Cows in which the largest follicle during luteolysis was the ovulatory follicle presented shorter periods of follicular growth (3.71±0.56×5.26±0.34 days; P 0.05) and luteolysis to estrous intervals (85.71±14.68×121.33±8.34 hours; P 0.05). This study shows that functional (but not morphological) regression of corpus luteum and follicular dynamics after spontaneous or induced luteolysis are similar in Gir cattle.

A regressão luteal e a dinâmica folicular foram avaliadas durante o período de regressão luteal natural (n=14) ou após a indução artificial da luteólise pela aplicação de 500 g de cloprostenol (n=13), utilizando-se um aparelho portátil de ultra-som. Após a indução da luteólise foi detectada maior taxa de regressão luteal em 24 (0,89± 0,13×0,24± 0,17cm²/dia; P 0,05) e 48 horas (0,78±0,15×0,36±0,07cm²/dia P 0,05), porém a redução na concentração de progesterona foi semelhante (P>0,05). Não houve diferença (P>0,05) nas características da dinâmica folicular entre os dois grupos. No momento da luteólise, quando havia um folículo dominante funcional, observou-se redução na duração do crescimento folicular (3,71±0,56×5,26±0,34 dias; P 0,05) e no intervalo luteólise-estro (85,71±14,68×121,33±8,34 horas; P 0,05). Os resultados demonstram que a regressão funcional do corpo lúteo e a dinâmica folicular são semelhantes após a luteólise natural ou induzida em vacas da raça Gir, e que o fator determinante no intervalo luteólise-estro é o estádio fisiológico dos folículos presentes.

Efeito de sistema de cultivo, célula somática e soro em co-cultura sobre o desenvolvimento de embriões bovinos fecundados in vitro / Effects of culture system, somatic cells and serum in co-culture on the development of in vitro fertilized bovine embryos

O objetivo deste experimento foi o de avaliar o efeito de sistemas de cultivo e de diferentes células somáticas e soro bovino na co-cultura sobre a produção de embriões bovinos fecundados in vitro. No experimento um avaliou-se o efeito do sistema de co-cultura com células da tuba uterina e do sistema "definido". No experimento dois utilizaram-se células da granulosa ou da tuba uterina para a co-cultura em meio CR1aa (Charles Rosenkrans). No experimento três utilizou-se soro de vaca em cio (SVC) ou soro fetal bovino (SFB), ambos em co-cultura com células da granulosa em CR1aa. Os ovócitos utilizados foram obtidos de ovários colhidos em matadouro e maturados in vitro em meio 199 com soro de vaca em cio e FSH por 24h. Após a maturação, os ovócitos foram fecundados in vitro por 22h e posteriormente divididos aleatoriamente nos tratamentos. Avaliaram-se a taxa de clivagem no dia três do cultivo, a produção de blastocistos nos dias sete e oito, e de blastocistos eclodidos nos dias nove e dez. Não houve diferença entre os sistemas em co-cultura e "definido" quanto à taxa de clivagem (80,7% e 75,4%) e de produção de blastocisto (19,4% e 17,7%). Entretanto, a taxa de blastocistos eclodidos foi superior para o sistema em co-cultura (37,5%) quando comparado com o sistema "definido" (8,7%). O cultivo embrionário em células da tuba uterina ou da granulosa resultaram em taxas de clivagem, produção de blastocisto e blastocistos eclodidos semelhantes entre si (65,5% e 66,7% de clivagem, 11,6% e 13,7% de blastocistos e 23,1% e 50,0% de blastocistos eclodidos; P>0,05), bem como o cultivo com SFB ou SVC (63,9% e 70,2% de clivagem, 14,3% e 8,7% de blastocisto e 41,2% e 33,3% de blastocistos eclodidos; P>0,05). Conclui-se que o sistema de cultivo "definido" pode ser utilizado para estudos com cultivo de embriões in vitro, no entanto, os resultados quanto à taxa de eclosão ainda são inferiores ao sistema em co-cultura... (AU)

The aims of this study were to evaluate the effects of culture system and different somatic cells and bovine serum in co-culture on in vitro production of bovine embryos. On the first experiment oviduct epithelial cells for co-culture system in CR1aa (Charles Rosenkrans) medium for "defined" system were studied. On the second experiment granulosa or oviduct epithelial cells, both in CR1aa medium were used. On the third experiment estrous cow serum (ECS) or fetal calf serum (FCS), both in granulosa cells co-culture in CR1aa medium was used. Bovine cumulus-oocytes complexes, obtained from ovaries collected at slaughterhouse, were matured in vitro in medium 199 added with ECS and FSH for 24h. Right after, the oocytes were fertilized in vitro for 22h and randomly divided in the treatments of the experiments. The cleavage rate was evaluated on day three, the blastocyst production on seventh and eighth days and the hatched blastocysts on ninth and tenth days. No differences were obtained (P>0.05) between co-culture and "defined" systems on the cleavage rate (80.7% and 75.4%) and on the blastocysts production (19.4% and 17.7%). However, the hatched blastocyst rate was higher (P<0.05) in the co-culture than in the "defined" system (37.5 and 8,7%, respectively). Similar results of embryo co-culture in oviduct epithelial and granulosa cell cultures were obtained regarding to similar cleavages, blastocyst and hatched blastocyst rates (65.5% and 66.7% of cleavage, 11.6% and 13.7% of blastocyst and 23.1% and 50.0% of hatched blastocyst; P>0.05), as well as with FCS and ECS (63.9% and 70.2% of cleavage, 14.3% and 8.7% of blastocyst and 41.2% and 33.3% of hatched blastocyst; P>0,05). The results show that the "defined" system can be used for in vitro embryo culture studies. Nevertheless, the hatched blastocyst rate was higher in co-culture system. Granulosa and oviduct epithelial cells had similar effects on the in vitro embryonic development... (AU)

Fecundação in vitro com sêmen de bovinos da raça Gir

The aim of this study was to evaluate the effects of differents sperm concentration and incubation time during in vitro fecundation on sperm penetration, monospermic fecundation and cleavage rates, using sperm of Gyr bulls. In vitro matured oocytes (n=817) were distributed into treatments to in vitro fertilization (IVF) in a factorial design, with two sperm concentration (2 and 4×10(6) spermatozoa/ml), two incubation time (12 and 18h) and two bulls (A and B). Viable spermatozoa were obtained by swin-up. The IVF was realized in Fert-Talp medium with heparin, on incubator with 5% CO2 and 95% humidity in air, at 39ºC. After insemination, 359 oocytes were fixed and stained to determine penetration and polyspermy rates. The remainder were co-cultivated in bovine oviduct epithelial cells and TCM-199, for 72h, to evaluate cleavage rate. The penetration, monospermic fecundation, and cleavage rates were not affected (P>0.05) by sperm concentration and incubation time. Higher (P 0.05) penetration and cleavage rates were observed for bull B (83.3 and 81.8%, respectively) than for bull A (66.3 and 64%, respectively). Bull B showed a tendency to present higher (P 0.07) polyspermy than bull A (16.4 and 6.25, respectively). No interactions among treatments were observed.

Estudaram-se os efeitos da concentração espermática e do tempo de incubação do sêmen com ovócitos, durante a fecundação in vitro, sobre as taxas de penetração espermática, de fecundação monoespermática e de clivagem, utilizando-se sêmen de touros da raça Gir. Ovócitos (n=817) maturados in vitro foram distribuídos em tratamentos visando à fecundação in vitro (FIV), em um delineamento fatorial 2×2×2, com duas concentrações espermáticas (2 e 4×10(6) espermatozóides/ml), dois períodos de incubação (12 e 18h) e dois touros (A e B). Espermatozóides viáveis foram obtidos pela técnica de swin-up. A FIV foi realizada em meio fert-talp com heparina, em incubadora com 5% de CO2 em ar atmosférico e 95% de umidade, a 39ºC. Após inseminação, 359 ovócitos foram fixados e corados para determinação das taxa de penetração e poliespermia. O restante foi co-cultivado com células da tuba uterina e TCM-199 por 72h, avaliando-se a clivagem. As taxas de penetração, fecundação monoespermática e clivagem não foram influenciadas (P>0,05) pela concentração espermática e pelo período de incubação. O touro B produziu maiores taxas (P 0,05) de penetração e de clivagem (83,3 e 81,0%, respectivamente) do que o touro A (66,5 e 64,0%). Houve tendência do touro B apresentar maior taxa de polispermia (P=0,067) do que o touro A (16,4 e 6,2 %, respectivamente). As interações entre tratamentos não foram significativas (P>0,05). O efeito touro sobre a capacidade de fecundação dos espermatozóides deve ser considerado quando da fecundação in vitro.