Glutathione and IGF-1 in bovine seminal cryopreservation: oxidative stress response and pregnancy rate / [Glutationa e IGF-1 na criopreservação seminal bovina: resposta do estresse oxidativo e taxa de gestação]

The objective of this study was to evaluate the rate of conception, metabolic, and structural conditions of cryopreserved bovine sperm cells, plus extender with IGF-1 and glutathione (GSH). 12 ejaculations of Nelore bulls were used, submitted to treatments: control, gSH (2mM/mL), IGF-1 (100ng/mL) and gSH (1mM/mL) + IGF-1 (50ng/mL). After cryopreservation and thawing the semen passed the fast thermo resistance test (TTR), plasma membrane and acrosomal integrity (PIAI), mitochondrial membrane potential (AP), oxidative stress, and conception rate. Tukey test was used for the statistical analysis of the parametric variables and the Friedman test for nonparametric. The gestation percentage was compared by the Chi-square test. There was no statistical difference (P<0.05) between treatments for the TTRr variable. Otherwise in the oxidative stress evaluated with the CellROX probe was noted that the IGF-1 showed the highest number of reactive cells (P<0.05). The PIAI, AP and gestation rate showed no difference among treatments (P>0.05), with an average of conceptions of 36.58%. It is concluded that IGF-1, gSH and their association did not cause changes in sperm motility, mitochondrial potential, plasma and acrosomal membrane integrity. IGF-1 increased oxidative stress, however, there was no difference in the gestation rate among the treatments.(AU)

Objetivou-se avaliar a taxa de concepção, as condições metabólicas e estrutural das células espermáticas bovinas criopreservadas, acrescidas de diluidores com fator de crescimento semelhante à insulina do tipo 1(IGF-1) e glutationa (GSH). Foram utilizados 12 ejaculados de touros da raça Nelore, submetidos aos tratamentos: controle, gSH (2mM/mL), IGF-1 (100ng/mL) e gSH (1mM/mL) + IGF-1 (50ng/mL). Após a criopreservação e descongelação, o sêmen passou pelos testes de termorresistência rápida (TTRr), integridade de membrana plasmática e acrossomal (PIAI), alto potencial mitocondrial (AP), estresse oxidativo e taxa de concepção. Utilizou-se o teste de Tukey para as análises estatísticas das variáveis paramétricas e o teste de Friedman para as não paramétricas, com significância de 5%. A percentagem de gestação foi comparada pelo teste do qui-quadrado. Não hove diferença estatística (P<0,05) entre os tratamentos para a variável TTRr. Já no estresse oxidativo avaliado com a sonda CellROX, observou-se que o IGF-1 apresentou maior quantidade de células reativas (P<0,05), 36,38± 24,10. A PIAI, o AP e a taxa de gestação não apresentaram diferença entre tratamentos (P>0,05), com média de concepções de 36,58%. Conclui-se que o IGF-1, a gSH e a sua associação não causaram mudanças na motilidade espermática, no potencial mitocondrial, na integridade da membrana plasmática e acrossomal. O IGF-1 aumentou o estresse oxidativo, porém sem diferença na taxa de gestação entre os tratamentos.(AU)

Does supplementation of vitamin C, reduced glutathione or their association in semen extender reduce oxidative stress in bovine frozen semen? / A suplementação de vitamina C, glutationa reduzida ou sua associação no diluidor de sêmen reduz o estresse oxidativo no sêmen congelado bovino?

The aim of this study was to evaluate the addition of vitamin C, reduced glutathione and the association thereof to the bovine semen cryopreservation extender. The ejaculate from nine bulls were divided into four fractions, each corresponding to a treatment, namely: control group-semen diluted with Tris-yolk extender; vitamin C group-semen diluted in Tris-yolk extender supplemented with vitamin C (2.5mmol/mL); glutathione group-semen diluted in Tris-yolk extender supplemented with reduced glutathione (2.5mmol/mL) and associated group-semen diluted in Tris-yolk extender supplemented with vitamin C (1.25mmol/mL) and reduced glutathione (1.25mmol/mL). Afterwards, the semen was packed into French straws and submitted to cryopreservation using automated equipment. After cryopreservation, the semen was thawed and evaluated considering sperm motility, morphology, plasma membrane, acrosome, mitochondrial potential and oxidative stress, as well as the thermo resistance test. Extender's supplementation with the association of vitamin C and reduced glutathione showed benefic effects on sperm motility and preservation of plasma and acrosomal membranes during semen cryopreservation, being also the group that showed higher values of reactive oxygen species. Thus, the association of both antioxidants contributed to the preservation of sperm cells in every analyzed characteristic, suggesting its use on bovine semen cryopreservation.(AU)

O objetivo deste estudo foi avaliar a adição de vitamina C, glutationa reduzida e sua associação ao diluidor de criopreservação de sêmen bovino. O ejaculado de nove touros foi dividido em quatro frações, cada uma correspondendo a um tratamento, a saber: grupo controle - sêmen diluído em Tris-gema; grupo vitamina C - sêmen diluído em Tris-gema, suplementado com vitamina C (2,5mmol/mL); grupo glutationa - sêmen diluído em Tris-gema, suplementado com glutationa reduzida (2,5mmol/mL) e grupo sêmen associado - diluído em Tris-gema, suplementado com vitamina C (1,25mmol/mL) e glutationa reduzida (1,25mmol/mL ). Posteriormente, o sêmen foi envasado em palhetas francesas e submetido à criopreservação por meio de equipamento automatizado. Após a criopreservação, o sêmen foi descongelado e avaliado quanto à motilidade espermática, à morfologia, à membrana plasmática, ao acrossoma, ao potencial mitocondrial e ao estresse oxidativo, bem como pelo teste de resistência térmica. A suplementação de extensor com a associação de vitamina C e glutationa reduzida mostrou efeitos benéficos sobre a motilidade espermática e a preservação das membranas plasmática e acrossomal durante a criopreservação de sêmen, sendo também o grupo que apresentou maiores valores de espécies reativas de oxigênio. Assim, a associação de ambos os antioxidantes contribuiu para a preservação dos espermatozóides em todas as características analisadas, sugerindo sua utilização na criopreservação de sêmen bovino.(AU)

Does supplementation of vitamin C, reduced glutathione or their association in semen extender reduce oxidative stress in bovine frozen semen? / A suplementação de vitamina C, glutationa reduzida ou sua associação no diluidor de sêmen reduz o estresse oxidativo no sêmen congelado bovino?

The aim of this study was to evaluate the addition of vitamin C, reduced glutathione and the association thereof to the bovine semen cryopreservation extender. The ejaculate from nine bulls were divided into four fractions, each corresponding to a treatment, namely: control group-semen diluted with Tris-yolk extender; vitamin C group-semen diluted in Tris-yolk extender supplemented with vitamin C (2.5mmol/mL); glutathione group-semen diluted in Tris-yolk extender supplemented with reduced glutathione (2.5mmol/mL) and associated group-semen diluted in Tris-yolk extender supplemented with vitamin C (1.25mmol/mL) and reduced glutathione (1.25mmol/mL). Afterwards, the semen was packed into French straws and submitted to cryopreservation using automated equipment. After cryopreservation, the semen was thawed and evaluated considering sperm motility, morphology, plasma membrane, acrosome, mitochondrial potential and oxidative stress, as well as the thermo resistance test. Extender's supplementation with the association of vitamin C and reduced glutathione showed benefic effects on sperm motility and preservation of plasma and acrosomal membranes during semen cryopreservation, being also the group that showed higher values of reactive oxygen species. Thus, the association of both antioxidants contributed to the preservation of sperm cells in every analyzed characteristic, suggesting its use on bovine semen cryopreservation.(AU)

O objetivo deste estudo foi avaliar a adição de vitamina C, glutationa reduzida e sua associação ao diluidor de criopreservação de sêmen bovino. O ejaculado de nove touros foi dividido em quatro frações, cada uma correspondendo a um tratamento, a saber: grupo controle - sêmen diluído em Tris-gema; grupo vitamina C - sêmen diluído em Tris-gema, suplementado com vitamina C (2,5mmol/mL); grupo glutationa - sêmen diluído em Tris-gema, suplementado com glutationa reduzida (2,5mmol/mL) e grupo sêmen associado - diluído em Tris-gema, suplementado com vitamina C (1,25mmol/mL) e glutationa reduzida (1,25mmol/mL ). Posteriormente, o sêmen foi envasado em palhetas francesas e submetido à criopreservação por meio de equipamento automatizado. Após a criopreservação, o sêmen foi descongelado e avaliado quanto à motilidade espermática, à morfologia, à membrana plasmática, ao acrossoma, ao potencial mitocondrial e ao estresse oxidativo, bem como pelo teste de resistência térmica. A suplementação de extensor com a associação de vitamina C e glutationa reduzida mostrou efeitos benéficos sobre a motilidade espermática e a preservação das membranas plasmática e acrossomal durante a criopreservação de sêmen, sendo também o grupo que apresentou maiores valores de espécies reativas de oxigênio. Assim, a associação de ambos os antioxidantes contribuiu para a preservação dos espermatozóides em todas as características analisadas, sugerindo sua utilização na criopreservação de sêmen bovino.(AU)

Ferramentas para avaliação da funcionalidade da mitocôndria espermática / Tools for evaluating the functionality of sperm mitochondria

A mitocôndria é a principal fonte de energia para a motilidade e a homeostase espermática. Durante afosforilação oxidativa são produzidos metabólitos, denominados espécies reativas de oxigênio (EROs), as quaisdesempenham papel fundamental nos processos fisiológicos. No entanto, disfunções mitocondriais podem causardesequilíbrio entre a produção de EROs e os mecanismos antioxidantes, provocando o estresse oxidativo, letalpara a célula espermática. Assim, como essa organela está envolvida tanto nos processos fisiológicos quanto nospatológicos dos espermatozoides, fica clara a importância de se avaliar sua funcionalidade. Portanto, o objetivodesta revisão é descrever as possíveis técnicas de avaliação da funcionalidade das mitocôndrias espermáticas pormeio da atividade e do potencial da membrana mitocondrial, da mensuração dos níveis de ATP e ADP e damensuração dos níveis de cálcio.(AU)

Mitochondria are the major source of energy for sperm motility and to the homeostasis. During theoxidative phosphorylation metabolites called Reactive Oxygen Species (ROS), are produced and play a key rolefor the physiological processes. However, mitochondrial dysfunctions can cause an imbalance between ROSproduction and antioxidant mechanisms cause oxidative stress, lethal for spermatozoa. Thus, as this organelle isinvolved both in physiological or pathological processes of sperm, it is clear the importance of evaluating itsfunctionality. Therefore, the aim of this review is to describe the possible techniques for assessing functionalityof sperm mitochondria and these assessments of activity and mitochondrial membrane potential, measuring thelevels of ATP and ADP and measurement the levels of calcium.(AU)

Investigando a fragmentação não induzida e a susceptibilidade à fragmentação do DNA espermático: refinamento da avaliação espermática. Parte 2 / Investigating not induced fragmentation and susceptibility of sperm DNA: refinement of sperm evaluation. Second part

A integridade do DNA espermático está intimamente relacionada com a fertilidade. Técnicas queavaliam o DNA espermático possuem grande importância e potencial de serem aplicadas nas rotinas dasavaliações andrológicas. No entanto, são necessários maiores conhecimentos sobre as técnicas e seus princípiospara permitir que sejam empregadas apropriadamente de acordo com os objetivos e resultados esperados. Dessaforma, assim como abordado na Parte 1, nesta Parte 2 serão abordadas técnicas de avaliação do DNAespermático: TUNEL, laranja de acridina e Sperm Chromatin Structure Assay (SCSA). A técnica de TUNELfundamenta-se na adição de nucleotídeos modificados marcados com fluorescência às fitas fragmentadas. Atécnica avalia, portanto, diretamente a fragmentação de DNA da amostra. A sonda laranja de acridina é capaz dediferenciar, por meio de diferentes colorações, o DNA fragmentado do não fragmentado. Já a técnica de SCSAbaseia-se na imposição de um desafio ao espermatozoide; esta técnica avalia a susceptibilidade dosespermatozoides à fragmentação de DNA, sendo, portanto, uma avaliação indireta. A presente revisão permiteexpor a opinião dos autores sobre as diferentes técnicas e suas aplicações, mostrando o potencial emprego delasnos exames de rotina e nas pesquisas.(AU)

Sperm DNA integrity is directly related to male fertility. Techniques to assess sperm DNA are importantand have potential to be applied in routine evaluation of semen. However, the techniques and principles need tobe further studied to apply they correctly and to get relevant results. Thus, as discussed in Part 1, Part 2 willaddress evaluation techniques of sperm DNA: TUNEL, acridine orange and Sperm Chromatin Structure Assay(SCSA). TUNEL is based on addition of modified nucleotides labeled with fluorescence to fragmented tapesevaluating, therefore, directly, the DNA fragmentation of the sample. Acridine orange differentiates fragmentedDNA by different colors. On the other hand, SCSA are based on the imposition of a challenge to sperm. Thus,this technique assesses the susceptibility of sperm DNA fragmentation constituting indirect assessment. Thereview allows showing opinion of the authors about different techniques and their applications. Therefore,potential use of these techniques in routine exams and researches are addressed.(AU)

Investigando a compactação e a fragmentação não induzida do DNA espermático: refinamento da avaliação espermática parte 1 / Investigating condensation and not induced fragmentation of sperm DNA: Refinement of sperm evaluation first part

O DNA espermático possui papel essencial na reprodução, visto que danos no material genético podemprejudicar os processos de fecundação e desenvolvimento embrionário. Ademais, há evidências de que danos aoDNA podem ser causados por alterações epigenéticas. Entretanto, embora ainda não seja aplicada nas avaliaçõesandrológicas de rotina, faz-se essencial a avaliação do status de integridade do DNA espermático. Existemdiversas técnicas de avaliação com diferentes princípios e objetivos. A aplicação destas irá depender dosequipamentos disponíveis, do treinamento da equipe e das respostas a serem obtidas. Ainda, para a interpretaçãodos resultados obtidos, é necessário o conhecimento do princípio de análise de cada técnica. Assim, a presenterevisão, dividida em duas partes, tem por objetivo abordar diferentes técnicas de avaliação. As técnicasabordadas na parte 1 estão relacionadas às avaliações de compactação da cromatina (azul de toluidina, azul deanilina e cromomicina A3) e à avaliação direta da fragmentação de DNA (ensaio Cometa e teste de dispersão dacromatina modificado). Na parte 2, serão abordadas as técnicas de TUNEL, laranja de acridina e “SpermChromatin Structure Assay” (SCSA). Nesta revisão, serão abordados os princípios dos testes e a interpretaçãodos resultados baseados na literatura e nas pesquisas do grupo.(AU)

Sperm DNA has an important role on reproduction. Injuries in genetic material can impair thefertilization processes and embryonic development. Furthermore, there is evidence that DNA damage can becaused by epigenetic alterations. Although DNA evaluation in sperm analysis routine assessments is essential, itis not yet performed. There are numerous techniques of DNA evaluation with different principles and objectives.Application of these techniques will depend on the equipment available, the staff training and answers to berequired. To interpret the results, however, knowledge of each analysis technique is required. Therefore, thisreview, divided in two parts, aims to consider different techniques. The techniques that will be consideredthroughout the first part of review are: toluidine blue, aniline blue, A3 chromomycyn, Comet assay anddispersion test of modified chromatin. In the second part, it will be approached TUNEL, acridine orange andSperm Chromatin Structure Assay (SCSA) techniques. We will discuss the testes and the main results based onliterature and researches of our group.(AU)

Investigando a compactação e a fragmentação não induzida do DNA espermático: refinamento da avaliação espermática – parte 1 / Investigating condensation and not induced fragmentation of sperm DNA: Refinement of sperm evaluation – first part

O DNA espermático possui papel essencial na reprodução, visto que danos no material genético podemprejudicar os processos de fecundação e desenvolvimento embrionário. Ademais, há evidências de que danos aoDNA podem ser causados por alterações epigenéticas. Entretanto, embora ainda não seja aplicada nas avaliaçõesandrológicas de rotina, faz-se essencial a avaliação do status de integridade do DNA espermático. Existemdiversas técnicas de avaliação com diferentes princípios e objetivos. A aplicação destas irá depender dosequipamentos disponíveis, do treinamento da equipe e das respostas a serem obtidas. Ainda, para a interpretaçãodos resultados obtidos, é necessário o conhecimento do princípio de análise de cada técnica. Assim, a presenterevisão, dividida em duas partes, tem por objetivo abordar diferentes técnicas de avaliação. As técnicasabordadas na parte 1 estão relacionadas às avaliações de compactação da cromatina (azul de toluidina, azul deanilina e cromomicina A3) e à avaliação direta da fragmentação de DNA (ensaio Cometa e teste de dispersão dacromatina modificado). Na parte 2, serão abordadas as técnicas de TUNEL, laranja de acridina e “SpermChromatin Structure Assay” (SCSA). Nesta revisão, serão abordados os princípios dos testes e a interpretaçãodos resultados baseados na literatura e nas pesquisas do grupo.

Sperm DNA has an important role on reproduction. Injuries in genetic material can impair thefertilization processes and embryonic development. Furthermore, there is evidence that DNA damage can becaused by epigenetic alterations. Although DNA evaluation in sperm analysis routine assessments is essential, itis not yet performed. There are numerous techniques of DNA evaluation with different principles and objectives.Application of these techniques will depend on the equipment available, the staff training and answers to berequired. To interpret the results, however, knowledge of each analysis technique is required. Therefore, thisreview, divided in two parts, aims to consider different techniques. The techniques that will be consideredthroughout the first part of review are: toluidine blue, aniline blue, A3 chromomycyn, Comet assay anddispersion test of modified chromatin. In the second part, it will be approached TUNEL, acridine orange andSperm Chromatin Structure Assay (SCSA) techniques. We will discuss the testes and the main results based onliterature and researches of our group.

Ferramentas para avaliação da funcionalidade da mitocôndria espermática / Tools for evaluating the functionality of sperm mitochondria

A mitocôndria é a principal fonte de energia para a motilidade e a homeostase espermática. Durante afosforilação oxidativa são produzidos metabólitos, denominados espécies reativas de oxigênio (EROs), as quaisdesempenham papel fundamental nos processos fisiológicos. No entanto, disfunções mitocondriais podem causardesequilíbrio entre a produção de EROs e os mecanismos antioxidantes, provocando o estresse oxidativo, letalpara a célula espermática. Assim, como essa organela está envolvida tanto nos processos fisiológicos quanto nospatológicos dos espermatozoides, fica clara a importância de se avaliar sua funcionalidade. Portanto, o objetivodesta revisão é descrever as possíveis técnicas de avaliação da funcionalidade das mitocôndrias espermáticas pormeio da atividade e do potencial da membrana mitocondrial, da mensuração dos níveis de ATP e ADP e damensuração dos níveis de cálcio.

Mitochondria are the major source of energy for sperm motility and to the homeostasis. During theoxidative phosphorylation metabolites called Reactive Oxygen Species (ROS), are produced and play a key rolefor the physiological processes. However, mitochondrial dysfunctions can cause an imbalance between ROSproduction and antioxidant mechanisms cause oxidative stress, lethal for spermatozoa. Thus, as this organelle isinvolved both in physiological or pathological processes of sperm, it is clear the importance of evaluating itsfunctionality. Therefore, the aim of this review is to describe the possible techniques for assessing functionalityof sperm mitochondria and these assessments of activity and mitochondrial membrane potential, measuring thelevels of ATP and ADP and measurement the levels of calcium.

Investigando a fragmentação não induzida e a susceptibilidade à fragmentação do DNA espermático: refinamento da avaliação espermática. Parte 2 / Investigating not induced fragmentation and susceptibility of sperm DNA: refinement of sperm evaluation. Second part

A integridade do DNA espermático está intimamente relacionada com a fertilidade. Técnicas queavaliam o DNA espermático possuem grande importância e potencial de serem aplicadas nas rotinas dasavaliações andrológicas. No entanto, são necessários maiores conhecimentos sobre as técnicas e seus princípiospara permitir que sejam empregadas apropriadamente de acordo com os objetivos e resultados esperados. Dessaforma, assim como abordado na Parte 1, nesta Parte 2 serão abordadas técnicas de avaliação do DNAespermático: TUNEL, laranja de acridina e Sperm Chromatin Structure Assay (SCSA). A técnica de TUNELfundamenta-se na adição de nucleotídeos modificados marcados com fluorescência às fitas fragmentadas. Atécnica avalia, portanto, diretamente a fragmentação de DNA da amostra. A sonda laranja de acridina é capaz dediferenciar, por meio de diferentes colorações, o DNA fragmentado do não fragmentado. Já a técnica de SCSAbaseia-se na imposição de um desafio ao espermatozoide; esta técnica avalia a susceptibilidade dosespermatozoides à fragmentação de DNA, sendo, portanto, uma avaliação indireta. A presente revisão permiteexpor a opinião dos autores sobre as diferentes técnicas e suas aplicações, mostrando o potencial emprego delasnos exames de rotina e nas pesquisas.

Sperm DNA integrity is directly related to male fertility. Techniques to assess sperm DNA are importantand have potential to be applied in routine evaluation of semen. However, the techniques and principles need tobe further studied to apply they correctly and to get relevant results. Thus, as discussed in Part 1, Part 2 willaddress evaluation techniques of sperm DNA: TUNEL, acridine orange and Sperm Chromatin Structure Assay(SCSA). TUNEL is based on addition of modified nucleotides labeled with fluorescence to fragmented tapesevaluating, therefore, directly, the DNA fragmentation of the sample. Acridine orange differentiates fragmentedDNA by different colors. On the other hand, SCSA are based on the imposition of a challenge to sperm. Thus,this technique assesses the susceptibility of sperm DNA fragmentation constituting indirect assessment. Thereview allows showing opinion of the authors about different techniques and their applications. Therefore,potential use of these techniques in routine exams and researches are addressed.

Criopreservação do sêmen equino: uma revisão / Cryopreservation of equine semen: a review

A criopreservação de sêmen equino tem se difundido cada vez em território nacional. Os processos de congelação e descongelação levam a efeitos deletérios sobre o espermatozoide, diminuindo sua taxa de motilidade e vigor e, consequentemente, influenciando sua morfologia. Estudos vêm sendo realizados em busca do melhor crioprotetor ou associação de crioprotetores para minimizar os danos sofridos sobre os espermatozoides equinos. Nesta revisão de literatura, foram explorados aspectos fundamentais para a criopreservação do sêmen equino, com ênfase para choque térmico, composição de membrana plasmática, efeitos da congelação de diluidores e, principalmente, de crioprotetores. (AU)

Cryopreservation of equine semen is becoming more widespread in the country, but the process of freezing and thawing leads some deleterious effects on sperm, thereby decreasing its rate of motility and strength, that influences in the morphology of sperm. Therefore, studies are being conducted looking for the best cryoprotectant or combination of cryoprotectants to minimize the damage on sperm horses. In this literature review were explored key aspects for the cryopreservation of equine semen, highlighting the issues, thermal shock, the composition of the plasma membrane, effects of freezing extenders, mainly cryoprotectants. (AU)

Criopreservação do sêmen equino: uma revisão / Cryopreservation of equine semen: a review

A criopreservação de sêmen equino tem se difundido cada vez em território nacional. Os processos de congelação e descongelação levam a efeitos deletérios sobre o espermatozoide, diminuindo sua taxa de motilidade e vigor e, consequentemente, influenciando sua morfologia. Estudos vêm sendo realizados em busca do melhor crioprotetor ou associação de crioprotetores para minimizar os danos sofridos sobre os espermatozoides equinos. Nesta revisão de literatura, foram explorados aspectos fundamentais para a criopreservação do sêmen equino, com ênfase para choque térmico, composição de membrana plasmática, efeitos da congelação de diluidores e, principalmente, de crioprotetores.

Cryopreservation of equine semen is becoming more widespread in the country, but the process of freezing and thawing leads some deleterious effects on sperm, thereby decreasing its rate of motility and strength, that influences in the morphology of sperm. Therefore, studies are being conducted looking for the best cryoprotectant or combination of cryoprotectants to minimize the damage on sperm horses. In this literature review were explored key aspects for the cryopreservation of equine semen, highlighting the issues, thermal shock, the composition of the plasma membrane, effects of freezing extenders, mainly cryoprotectants.

Orquiepididimite em carneiro por Salmonella enterica sub-diarizonae: primeiro caso na América do Sul / Orchiepididymitis in ram by Salmonella enterica sub diarizonae: first case in South America

O objetivo deste artigo é relatar um caso de orquiepididimite associado com infecção por Salmonella enterica subespécie diarizonae em carneiro da raça Santa Inês de quatro anos de idade, vasectomizado. Ao exame clínico reprodutivo, o animal mostrou aumento severo do conteúdo escrotal, sendo o testículo direito maior do que o esquerdo e a cauda do epidídimo direita maior do que a esquerda. A consistência testicular, avaliada em escala de 1 a 5, foi 5 para o testículo direito e 2,5 para o esquerdo; o órgão apresentava-se muito sensível ao toque. Na ultrassonografia foram observadas estruturas anecoicas/hipoecoicas circulares na cauda do epidídimo, sugestivas de abscessos; alguns pontos hiperecogênicos no parênquima testicular, sugerindo lesões de calcificação; e todo o testículo direito rodeado por imagem hipoecoica, indicativa de edema. Uma das estruturas da cauda do epidídimo direita foi puncionada, encontrando-se exsudato purulento, o qual foi enviado para exame microbiológico, sendo isolada e identificada Salmonella enterica subespécie diarizonae. O carneiro foi submetido a orquiepididectomia, e o órgão foi caracterizado macroscopicamente por adesões fibrosas entre as camadas escrotais, coexistência de abscessos epididimários e degeneração testicular. A Salmonella enterica subespécie diarizonae deve ser considerada no diagnóstico diferencial de infecção genital em ovinos.(AU)

The objective of this manuscript was to report a case of orchiepididymitis associated with Salmonella enterica subespécie diarizonae infection in a vasectomized 4-year-old Santa Inês ram. In the clinical-reproductive examination, the animal showed a severe enlargement of the scrotal contents, being the right testicle larger than left, and the right epididymal cauda was higher than the left. The testicular consistency, evaluated in a scale from 1 to 5, was 5 to the right and 2.5 to the left, and the organ was very sensitive to the touch. In the ultrasound circular structures anechoic/hypoechoic in the epididymal cauda were observed, and in the parenchyma of testicles some points of hyperechogenic image, suggesting calcification lesions and the entire right testicle was surrounded by hypoechoic image, indicative of edema. One of those structures of the right epididymal cauda was aspirated and a purulent exsudate was found, which was sent to microbiological exam, was isolated and identified Salmonella enterica subespécie diarizonae. The ram was submitted to orchiepididectomy, and the organ was characterized macroscopically by fibrous adhesions between scrotum layers, coexistence of epididymal abscesses and testicular degeneration. The Salmonella enterica subspecie diarizonae must be taken into account in the differential diagnosis of ovine genital infections.(AU)

Aspects related to the technique and the utilization of sexed semen in vivo and in vitro

The development of methods capable of selecting the sex of animals has always been a great challenge for humankind. Separating X chromosome- bearing and Y chromosome-bearing sperm based on DNA difference using flow cytometry is the only technique that has achieved a useful level of progress, especially in cattle. This allowed the technique to be commercially applicable in this species. Thorough this review, aspects related to the sexing technique (flow cytometry) and to the sperm will be discussed along with the in vitro use of sexed semen. Besides, number of sperm used and semen deposition location, the influence of reproductive status (heifers vs. cows), time of insemination and production of embryos in superovulated donors will be reviewed.

Aspects related to the technique and the utilization of sexed semen in vivo and in vitro

The development of methods capable of selecting the sex of animals has always been a great challenge for humankind. Separating X chromosome- bearing and Y chromosome-bearing sperm based on DNA difference using flow cytometry is the only technique that has achieved a useful level of progress, especially in cattle. This allowed the technique to be commercially applicable in this species. Thorough this review, aspects related to the sexing technique (flow cytometry) and to the sperm will be discussed along with the in vitro use of sexed semen. Besides, number of sperm used and semen deposition location, the influence of reproductive status (heifers vs. cows), time of insemination and production of embryos in superovulated donors will be reviewed.(AU)

Métodos de avaliação da morfologia e função espermática: momento atual e desafios futuros / Methods of the assessment of morphology and function of sperm: actual moment and future challenges

Com o propósito de obter resultados que demonstrem maior repetibilidade na avaliação da morfologia tanto quanto na função espermática, diversas técnicas laboratoriais tem sido desenvolvidas. Surgiram sistemas que utilizam a análise computadorizada de imagens, métodos de “coloração” empregando corantes fluorescentes (sondas fluorescentes) em microscopia de epifluorescência ou citometria de fluxo, que aumentaram a possibilidade de uma análise mais criteriosa da integridade estrutural dos espermatozóides. Os autores descrevem experiências, por mais de uma década, com a utilização destas biotécnicas, fazendo uma análise crítica, bem como apontando os desafios futuros, inclusive na área de biologia molecular espermática.(AU)

In order to obtain results showing greater repeatability in morphology and sperm function assessment, several laboratorial techniques have been developed continuously. Systems that utilize computerized image analysis, staining methods using fluorescent dies (fluorescent probes) in epifluorescence microscopy or flow cytometry, that allowed a more judicious evaluation of sperm structure integrity arose. Authors describe experiences, over a decade, with the use of these biotechiques, critically analyzing and pointing out future challenges, including the field of sperm molecular biology.(AU)

Métodos de avaliação da morfologia e função espermática: momento atual e desafios futuros / Methods of the assessment of morphology and function of sperm: actual moment and future challenges

Com o propósito de obter resultados que demonstrem maior repetibilidade na avaliação da morfologia tanto quanto na função espermática, diversas técnicas laboratoriais tem sido desenvolvidas. Surgiram sistemas que utilizam a análise computadorizada de imagens, métodos de “coloração” empregando corantes fluorescentes (sondas fluorescentes) em microscopia de epifluorescência ou citometria de fluxo, que aumentaram a possibilidade de uma análise mais criteriosa da integridade estrutural dos espermatozóides. Os autores descrevem experiências, por mais de uma década, com a utilização destas biotécnicas, fazendo uma análise crítica, bem como apontando os desafios futuros, inclusive na área de biologia molecular espermática.

In order to obtain results showing greater repeatability in morphology and sperm function assessment, several laboratorial techniques have been developed continuously. Systems that utilize computerized image analysis, staining methods using fluorescent dies (fluorescent probes) in epifluorescence microscopy or flow cytometry, that allowed a more judicious evaluation of sperm structure integrity arose. Authors describe experiences, over a decade, with the use of these biotechiques, critically analyzing and pointing out future challenges, including the field of sperm molecular biology.

Simultaneous assessment of plasmatic, acrosomal, and mitochondrial membranes in ram sperm by fluorescent probes / Avaliação simultânea das membranas plasmática, acrossomal e mitocondrial de espermatozoides de carneiros por sondas fluorescentes

In this experiment, it was defined a protocol of fluorescent probes combination: propidium iodide (PI), fluorescein isothiocyanate-conjugated Pisum sativum agglutinin (FITC-PSA), and JC-1. For this purpose, four ejaculates from three different rams (n=12), all showing motility >80 percent and abnormal morphology <10 percent, were diluted in TALP medium and split into two aliquots. One of the aliquots was flash frozen and thawed in three continuous cycles, to induce damage in cellular membranes and to disturb mitochondrial function. Three treatments were prepared with the following fixed ratios of fresh semen:flash frozen semen: 0:100 (T0), 50:50 (T50), and 100:0 (T100). Samples were stained in the proposal protocol and evaluated by epifluorescence microscopy. For plasmatic membrane integrity, detected by PI probe, it was obtained the equation: v=1.09+0.86X (R²=0.98). The intact acrosome, verified by the FITC-PSA probe, produced the equation: v=2.76+0.92X (R²=0.98). The high mitochondrial membrane potential, marked in red-orange by JC-1, was estimated by the equation: v=1.90+0.90X (R²=0.98). The resulting linear equations demonstrate that this technique is efficient and practical for the simultaneous evaluations of the plasmatic, acrosomal, and mitochondrial membranes in ram spermatozoa.(AU)

Neste experimento, foi definida uma combinação de sondas fluorescentes: iodeto de propídio (PI), aglutinina de Pisum sativum conjugada ao isotiocionato de fluoresceína (FITC-PSA) e JC-1. Para esta proposta, quatro ejaculados de três carneiros (n=12), que apresentavam motilidade >80 por cento e alterações morfológicas <10 por cento, foram diluídos em meio TALP e divididos em duas alíquotas. Uma alíquota foi submetida a três ciclos de flash frozen e descongelação, para induzir danos nas membranas celulares e distúrbios na função mitocondrial. Três tratamentos foram preparados com as seguintes proporções preestabelecidas de sêmen fresco: sêmen submetido a flash frozen: 0:100 (T0), 50:50 (T50) e 100:0 (T100). As amostras foram coradas no protocolo proposto e avaliadas por microscopia de epifluorescência. Para integridade de membrana plasmática, detectada pela sonda PI, foi obtida a equação: v=1,09+0,86X (R²=0,98). O acrossomo intacto, verificado pela sonda FITC-PSA, produziu a equação: v=2,76+0,92X (R²=0,98). O alto potencial de membrana mitocondrial, marcada em vermelho-alaranjado pelo JC-1, foi estimado pela equação: v=1,90+0,90X (R²=0,98). As equações lineares resultantes demonstraram que a técnica é eficiente e prática para avaliação simultânea das membranas plasmática, acrossomal e mitocondrial em espermatozoides de carneiros.(AU)