Evaluation of recombinant Cryptosporidium hominis GP60 protein and anti-GP60 chicken polyclonal IgY for research and diagnostic purposes / Avaliação da proteína recombinante GP60 de Cryptosporidium hominis e da IgY policlonal anti-GP60 recombinante para uso em pesquisa e diagnóstico

In this study, a method for expressing Cryptosporidium hominis GP60 glycoprotein in Escherichia coli for production of polyclonal anti-GP60 IgY in chickens was developed aiming future studies concerning the diagnosis, prevention and treatment of cryptosporidiosis. The full-length nucleotide sequence of the C. hominis gp60 gene was codon-optimized for expression in E. coli and was synthesized in pET28-a vector. Subcloning was performed on several different strains of BL21 E. coli. Temperature, time and inducer IPTG concentration assays were also performed and analyzed using SDS-PAGE. The optimal conditions were observed at a temperature of 37 °C, with overnight incubation and 1 mM of IPTG. Purification was performed by means of affinity chromatography using the AKTA Pure chromatography system and the Hi-Trap HP column (GE Healthcare). The recombinant protein GP60 (rGP60) thus generated was used to immunize laying hens owing the production of polyclonal IgY. Western blot and indirect immunofluorescence showed that the polyclonal antibody was capable of binding to rGP60 and to Cryptosporidium parvum sporozoites, respectively. The rGP60 and the IgY anti-rGP60 generated in this study may be used as templates for research and for the development of diagnostic methods for cryptosporidiosis.(AU)

Neste trabalho, foi desenvolvido um método de expressão da glicoproteína GP60 de Cryptosporidium hominis em Escherichia coli visando produzir anticorpos IgY anti-GP60 em galinhas para utilização em estudos futuros com os objetivos de diagnóstico, prevenção e tratamento da criptosporidiose. A sequência completa de nucleotídeos do gene gp60 de C. hominis foi códon-otimizada para expressão em E. coli e sintetizada no vetor pET28-a. A subclonagem foi realizada em várias estirpes diferentes de E. coli BL21. Os ensaios de concentração do indutor IPTG, temperatura e tempo foram realizados e analisados por SDS-PAGE. As condições ótimas de expressão foram observadas em temperatura de 37 °C, incubação durante a noite e 1 mM de IPTG. A purificação da proteína foi realizada por cromatografia de afinidade utilizando o sistema de cromatografia AKTA Pure e a coluna Hi-Trap HP (GE Healthcare). A proteína recombinante GP60 (rGP60) foi utilizada para imunizar galinhas poedeiras para produzir IgY policlonal anti-rGP60. Verificou-se por Western blot e por imunofluorescência indireta que o anticorpo policlonal apresentou reatividade com a rGP60 e com esporozoítos de Cryptosporidium parvum, respectivamente. A rGP60 e a IgY anti-rGP60 geradas neste estudo podem ser utilizadas como modelos para o desenvolvimento de ensaios para pesquisa e diagnóstico da criptosporidiose.(AU)

Avaliação da expressão gênica em leucócitos de eqüinos : análise pela técnica do microarray em modelo ex vivo de endotoxemia

Endotoxemia é distúrbio sistêmico que se origina da resposta do hospedeiro a um componente da membrana celular das bactérias Gram- negativas. Esta resposta se dá através da exposição dos receptores celulares TLR-4 e TLR-2 ao LPS. Os objetivos deste estudo foram investigar as alterações na expressão gênica da exposição ao LPS em leucócitos de equinos utilizando a técnica de microarray, avaliar a eficiência do modelo ex vivo para os estudos envolvendo a endotoxemia pela mesma técnica, avaliar a expressão global de genes em vias envolvidas, identificar componentes da cascata metabólica com potenciais para novas terapias, e fornecer subsídio para futuros estudos. Amostras de sangue total (15mL) de cavalos saudáveis (n=6) foram incubadas durante 4 horas a 37°C com 5% de CO2 na presença (1 ou 10 ng/mL) ou ausência de LPS (0 ng/mL). Alíquotas de 500µL de sangue foram coletadas nos momentos 0, 2 e 4 horas após o estímulo do LPS. O RNA, extraído das mostras, foi utilizado para a transcrição do cDNA. A hibridização do cDNA marcado com Cy-3 foi realizada em lâminas 4x44K v2 de humanos contendo sequências homólogas com a espécie equina para os genes de interesse. Após a leitura das lâminas, com filtro para genes 30x mais ou menos expressos, verificou-se um aumento da expressão do TLR-2 na concentração de 10 ng LPS/mL no momento 4 em relação ao momento 2. Este resultado sugere que, embora o receptor TLR-4 seja o principal receptor no reconhecimento do LPS, o receptor TLR-2 também tem um papel no reconhecimento destas moléculas

Endotoxemia is systemic disturbance that origins from the host response to a component of the cellular membrane of Gram-negative bacterias. This response occurs through exposure of cellular receptors TLR-4 and TLR-2 to LPS. The objectives of this study were to investigate changes in gene expression of exposure to LPS in horses leukocytes using the microarray technique, to evaluate the efficiency of the ex vivo model for studies of endotoxemia by the same technique, to evaluate the global expression of genes in the metabolic pathways involved, identify components of the metabolic cascade with potential for new therapies, and provide allowance for future studies. Whole blood samples (15mL) of healthy horses (n=6) were incubated for 4 hours at 37°C with 5% of CO2 in the presence (1 or 10 ng/ml) or absence of LPS (0 ng/ml). Aliquots of 500?L of blood were collected at 0,2 and 4 hours after LPS stimulation. The RNAs, extracted from the samples, were used for the transcription of the cDNAs. Hybridization of labeled cDNAs with Cy-3 were performed in 4x44K v2 slides containing human sequences homologous to the equine species for the genes of interest. After the reading of the slides with filter for genes 30x up regulation or down regulation expression, it was observed an increased expression of the TLR-2 concentration of 10 ng LPS/mL at time 4 compared to time 2. This result suggests that, although the TLR-4 receptor is the main LPS recognition receptor, the receptor TLR-2 also plays a role in recognition of these molecules