Chemical composition and in vitro inhibitory effects of essential oils from fruit peel of three Citrus species and limonene on mycelial growth of Sclerotinia sclerotiorum / Composição química e efeito inibitório in vitro dos óleos essenciais das cascas dos frutos de três espécies de Citrus e do limoneno sobre o crescimento micelial de Sclerotinia sclerotiorum

Essential oils (EO) from aromatic and medicinal plants generally perform a diverse range of biological activities because they have several active constituents that work in different mechanisms of action. EO from Citrus peel have an impressive range of food and medicinal uses, besides other applications. EO from Citrus reticulata, C. sinensis and C. deliciosa were extracted from fruit peel and analyzed by GC-MS. The major constituent of EO under evaluation was limonene, whose concentrations were 98.54%, 91.65% and 91.27% for C. sinensis, C. reticulata and C. deliciosa, respectively. The highest potential of inhibition of mycelial growth was observed when the oil dose was 300 L. Citrus oils inhibited fungus growth in 82.91% (C. deliciosa), 65.82% (C. sinensis) and 63.46% (C. reticulata). Anti-Sclerotinia sclerotiorum activity of 90% pure limonene and at different doses (20, 50, 100, 200 and 300 L) was also investigated. This monoterpene showed to be highly active by inhibiting 100% fungus growth even at 200 and 300 L doses. This is the first report of the in vitro inhibitory effect of natural products from these three Citrus species and its results show that there is good prospect of using them experimentally to control S. sclerotiorum, in both greenhouse and field conditions.(AU)

Óleos essenciais de plantas aromáticas e medicinais geralmente exibem uma gama diversificada de atividades biológicas, pois possuem vários constituintes ativos que atuam por meio de vários mecanismos de ação. Os óleos essenciais das cascas de Citrus têm uma variedade impressionante de usos em alimentos, medicamentos entre várias outras aplicações. Os óleos essenciais (OE) de Citrus reticulata, C. sinenses e C. deliciosa foram extraídos das cascas dos frutos e analisados por CG-EM. O limoneno foi o constituinte majoritário encontrado nos óleos essenciais avaliados, nas concentrações de 98,54%, 91,65% e 91,27% para C. sinensis, C. reticulata e C. deliciosa, respectivamente. Os maiores potenciais de inibição do crescimento micelial foi observado na dose de 300 µL dos óleos. Os óleos de Citrus inibiram em 82,91% (C. deliciosa), 65,82% (C. sinensis) e 63,46% (C. reticulata) o crescimento do fungo. A atividade anti-Sclerotinia sclerotiorum do limoneno 90% puro e em diferentes doses (20, 50, 100, 200 e 300 µL) foi também investigada e este monoterpeno demonstrou-se altamente ativo inibindo 100% o crescimento do fungo inclusive nas doses de 200 e 300 µL. Este é o primeiro relato sobre o efeito inibitório in vitro dos óleos essenciais destas três espécies de Citrus e os resultados deste estudo mostram que existe uma boa perspectiva de uso destes produtos naturais experimentalmente para controlar o S. sclerotiorum tanto em condições de estufa como em condições de campo.(AU)

Chemical composition and in vitro inhibitory effects of essential oils from fruit peel of three Citrus species and limonene on mycelial growth of Sclerotinia sclerotiorum

Abstract Essential oils (EO) from aromatic and medicinal plants generally perform a diverse range of biological activities because they have several active constituents that work in different mechanisms of action. EO from Citrus peel have an impressive range of food and medicinal uses, besides other applications. EO from Citrus reticulata, C. sinensis and C. deliciosa were extracted from fruit peel and analyzed by GC-MS. The major constituent of EO under evaluation was limonene, whose concentrations were 98.54%, 91.65% and 91.27% for C. sinensis, C. reticulata and C. deliciosa, respectively. The highest potential of inhibition of mycelial growth was observed when the oil dose was 300 L. Citrus oils inhibited fungus growth in 82.91% (C. deliciosa), 65.82% (C. sinensis) and 63.46% (C. reticulata). Anti-Sclerotinia sclerotiorum activity of 90% pure limonene and at different doses (20, 50, 100, 200 and 300 L) was also investigated. This monoterpene showed to be highly active by inhibiting 100% fungus growth even at 200 and 300 L doses. This is the first report of the in vitro inhibitory effect of natural products from these three Citrus species and its results show that there is good prospect of using them experimentally to control S. sclerotiorum, in both greenhouse and field conditions.

Resumo Óleos essenciais de plantas aromáticas e medicinais geralmente exibem uma gama diversificada de atividades biológicas, pois possuem vários constituintes ativos que atuam por meio de vários mecanismos de ação. Os óleos essenciais das cascas de Citrus têm uma variedade impressionante de usos em alimentos, medicamentos entre várias outras aplicações. Os óleos essenciais (OE) de Citrus reticulata, C. sinenses e C. deliciosa foram extraídos das cascas dos frutos e analisados por CG-EM. O limoneno foi o constituinte majoritário encontrado nos óleos essenciais avaliados, nas concentrações de 98,54%, 91,65% e 91,27% para C. sinensis, C. reticulata e C. deliciosa, respectivamente. Os maiores potenciais de inibição do crescimento micelial foi observado na dose de 300 µL dos óleos. Os óleos de Citrus inibiram em 82,91% (C. deliciosa), 65,82% (C. sinensis) e 63,46% (C. reticulata) o crescimento do fungo. A atividade anti-Sclerotinia sclerotiorum do limoneno 90% puro e em diferentes doses (20, 50, 100, 200 e 300 µL) foi também investigada e este monoterpeno demonstrou-se altamente ativo inibindo 100% o crescimento do fungo inclusive nas doses de 200 e 300 µL. Este é o primeiro relato sobre o efeito inibitório in vitro dos óleos essenciais destas três espécies de Citrus e os resultados deste estudo mostram que existe uma boa perspectiva de uso destes produtos naturais experimentalmente para controlar o S. sclerotiorum tanto em condições de estufa como em condições de campo.

Chemical composition and in vitro inhibitory effects of essential oils from fruit peel of three Citrus species and limonene on mycelial growth of Sclerotinia sclerotiorum

Abstract Essential oils (EO) from aromatic and medicinal plants generally perform a diverse range of biological activities because they have several active constituents that work in different mechanisms of action. EO from Citrus peel have an impressive range of food and medicinal uses, besides other applications. EO from Citrus reticulata, C. sinensis and C. deliciosa were extracted from fruit peel and analyzed by GC-MS. The major constituent of EO under evaluation was limonene, whose concentrations were 98.54%, 91.65% and 91.27% for C. sinensis, C. reticulata and C. deliciosa, respectively. The highest potential of inhibition of mycelial growth was observed when the oil dose was 300 L. Citrus oils inhibited fungus growth in 82.91% (C. deliciosa), 65.82% (C. sinensis) and 63.46% (C. reticulata). Anti-Sclerotinia sclerotiorum activity of 90% pure limonene and at different doses (20, 50, 100, 200 and 300 L) was also investigated. This monoterpene showed to be highly active by inhibiting 100% fungus growth even at 200 and 300 L doses. This is the first report of the in vitro inhibitory effect of natural products from these three Citrus species and its results show that there is good prospect of using them experimentally to control S. sclerotiorum, in both greenhouse and field conditions.

Resumo Óleos essenciais de plantas aromáticas e medicinais geralmente exibem uma gama diversificada de atividades biológicas, pois possuem vários constituintes ativos que atuam por meio de vários mecanismos de ação. Os óleos essenciais das cascas de Citrus têm uma variedade impressionante de usos em alimentos, medicamentos entre várias outras aplicações. Os óleos essenciais (OE) de Citrus reticulata, C. sinenses e C. deliciosa foram extraídos das cascas dos frutos e analisados por CG-EM. O limoneno foi o constituinte majoritário encontrado nos óleos essenciais avaliados, nas concentrações de 98,54%, 91,65% e 91,27% para C. sinensis, C. reticulata e C. deliciosa, respectivamente. Os maiores potenciais de inibição do crescimento micelial foi observado na dose de 300 µL dos óleos. Os óleos de Citrus inibiram em 82,91% (C. deliciosa), 65,82% (C. sinensis) e 63,46% (C. reticulata) o crescimento do fungo. A atividade anti-Sclerotinia sclerotiorum do limoneno 90% puro e em diferentes doses (20, 50, 100, 200 e 300 µL) foi também investigada e este monoterpeno demonstrou-se altamente ativo inibindo 100% o crescimento do fungo inclusive nas doses de 200 e 300 µL. Este é o primeiro relato sobre o efeito inibitório in vitro dos óleos essenciais destas três espécies de Citrus e os resultados deste estudo mostram que existe uma boa perspectiva de uso destes produtos naturais experimentalmente para controlar o S. sclerotiorum tanto em condições de estufa como em condições de campo.

Sex identification of domestic geese (Anser anser): comparison of cytogenetic analysis technique and post anesthetic inspection of the cloaca / Identificação do sexo de gansos domésticos (Anser anser): comparação da técnica de sexagem cromossômica e a inspeção pós-anestésica da cloaca

The domestic geese used in this experiment were free-living, from a lake located in an urban area and its population had increased dramatically. The need for a project proposing the sterilization of some males to restrain population growth, led to the need for sexing these animals. As domestic geese present minimal sexual dimorphism, two techniques were tested: cytogenetic analysis and post anesthetic inspection of the cloaca. There were used eight adults geese randomly chosen from a group of 80 animals. They were caught with nets or by hand, were individually transported and housed in appropriate place waiting for the cytogenetic analysis (three to four days). For the chromosomal sexing, was collected 2 mL of blood and the peripheral blood lymphocyte culture technique was used. The sample was treated with hypotonic KCl, fixed in three changes of methanol/acetic acid solution. The slides were prepared with the standard technique and examined under an optical microscope to observe the metaphase. To the technique of cloaca eversion, was performed injectable anesthesia with tiletamine-zolazepam 5%. Ten minutes after anesthesia, the cloaca has been everted to visualize the internal structures and sex determination. The techniques were performed in blinded trial to avoidinaccurate results. From the eight animals submitted to chromosomal sexing technique, five were identified as male and three as females, reaching 100% agreement when compared with the cloaca eversion technique. Sexing chromosomal technique appeared to cause the least discomfort in the animals evaluated, proving to be a reliable technique for sexualdetermination and favorable to animal welfare.

Os gansos domésticos utilizados neste experimento eram de vida livre, pertencentes a um lago localizado em uma área urbana e sua população havia aumentado dramaticamente. A necessidade de um projeto com foco na esterilização de alguns machos, para reduzir o crescimento populacional, levou à necessidade de sexagem desses animais. como os gansos domésticos apresentam mínimo dimorfismo sexual, duas técnicas foram testadas: análise citogenética e inspeção da cloaca pós-anestesia. Foram utilizados oito gansos adultos, escolhidos aleatoriamente de um grupo de 80 animais. Eles foram capturados com redes ou manualmente, transportados individualmente e alojados em local apropriado a espera da análise citogenética (três a quatro dias). Para a sexagem cromossomal, foram coletados 2 ml de sangue e a técnica de cultura de linfócitos periféricos foi empregada. As amostras resultantes foram tratadas com kcl hipotônico, fixadas em três trocas de solução de metanol e ácido acético. As lâminas foram preparadas com a técnica padrão e examinadas ao microscópio óptico para observação das metáfases. para a técnica de eversão da cloaca, foi realizada a anestesia injetável com tiletamina-zolazepam 5%. Dez minutos após a anestesia, a cloaca foi evertida para a visualização das estruturas internas e a determinação sexual. AAs técnicas foram conduzidas em duplo cego, para melhor acurácia dos resultados. Dos oito animais submetidos à técnica de sexagem cromossomal, cinco foram identificados como machos e três como fêmeas, alcançando 100% de concordância quando comparada com a técnica de eversão da cloaca. A técnica de sexagem cromossomal aparentou causar o menor desconforto nos animais avaliados, mostrando-se uma técnicaconfiável para determinação sexual e favorável ao bem-estar animal.

Sex identification of domestic geese (Anser anser): comparison of cytogenetic analysis technique and post anesthetic inspection of the cloaca / Identificação do sexo de gansos domésticos (Anser anser): comparação da técnica de sexagem cromossômica e a inspeção pós-anestésica da cloaca

The domestic geese used in this experiment were free-living, from a lake located in an urban area and its population had increased dramatically. The need for a project proposing the sterilization of some males to restrain population growth, led to the need for sexing these animals. As domestic geese present minimal sexual dimorphism, two techniques were tested: cytogenetic analysis and post anesthetic inspection of the cloaca. There were used eight adults geese randomly chosen from a group of 80 animals. They were caught with nets or by hand, were individually transported and housed in appropriate place waiting for the cytogenetic analysis (three to four days). For the chromosomal sexing, was collected 2 mL of blood and the peripheral blood lymphocyte culture technique was used. The sample was treated with hypotonic KCl, fixed in three changes of methanol/acetic acid solution. The slides were prepared with the standard technique and examined under an optical microscope to observe the metaphase. To the technique of cloaca eversion, was performed injectable anesthesia with tiletamine-zolazepam 5%. Ten minutes after anesthesia, the cloaca has been everted to visualize the internal structures and sex determination. The techniques were performed in blinded trial to avoidinaccurate results. From the eight animals submitted to chromosomal sexing technique, five were identified as male and three as females, reaching 100% agreement when compared with the cloaca eversion technique. Sexing chromosomal technique appeared to cause the least discomfort in the animals evaluated, proving to be a reliable technique for sexualdetermination and favorable to animal welfare. (AU)

Os gansos domésticos utilizados neste experimento eram de vida livre, pertencentes a um lago localizado em uma área urbana e sua população havia aumentado dramaticamente. A necessidade de um projeto com foco na esterilização de alguns machos, para reduzir o crescimento populacional, levou à necessidade de sexagem desses animais. como os gansos domésticos apresentam mínimo dimorfismo sexual, duas técnicas foram testadas: análise citogenética e inspeção da cloaca pós-anestesia. Foram utilizados oito gansos adultos, escolhidos aleatoriamente de um grupo de 80 animais. Eles foram capturados com redes ou manualmente, transportados individualmente e alojados em local apropriado a espera da análise citogenética (três a quatro dias). Para a sexagem cromossomal, foram coletados 2 ml de sangue e a técnica de cultura de linfócitos periféricos foi empregada. As amostras resultantes foram tratadas com kcl hipotônico, fixadas em três trocas de solução de metanol e ácido acético. As lâminas foram preparadas com a técnica padrão e examinadas ao microscópio óptico para observação das metáfases. para a técnica de eversão da cloaca, foi realizada a anestesia injetável com tiletamina-zolazepam 5%. Dez minutos após a anestesia, a cloaca foi evertida para a visualização das estruturas internas e a determinação sexual. AAs técnicas foram conduzidas em duplo cego, para melhor acurácia dos resultados. Dos oito animais submetidos à técnica de sexagem cromossomal, cinco foram identificados como machos e três como fêmeas, alcançando 100% de concordância quando comparada com a técnica de eversão da cloaca. A técnica de sexagem cromossomal aparentou causar o menor desconforto nos animais avaliados, mostrando-se uma técnicaconfiável para determinação sexual e favorável ao bem-estar animal. (AU)

Cytogenetic analysis of the 18S, 5S rDNA and B chromosome of Iheringichthys labrosus (Lütken, 1874) (Siluriformes, Pimelodidae) / Análise Citogenética de DNAr 18S, 5S e cromossomo B de Iheringichthys labrosus (Lütken, 1874) (Siluriformes, Pimelodidae)

Cytogenetic analyses of the location of 18S and 5S ribosomal DNAs, and the base composition of B chromosomes of Iheringichthys labrosus from Tibagi River, Paraná, Brazil, are provided. AgNORs were observed in the terminal position on the long arm of a subtelocentric chromosome pair. CMA3-positive staining was observed in some chromosomes, which besides being associated with NORs, were all DAPI-negative. Chromosome B showed a strong fluorescence with CMA3. The concomitant use of 18S and 5S rDNA probes using the FISH technique revealed 18S ribosomal cistrons in a pair of subtelocentric chromosomes, on the long arm in the terminal position, coinciding with the AgNOR. The 5S sites were found in another subtelocentric pair, on the long arm in the interstitial region, near the centromere. The findings of the present study suggest that, although there are some more conserved cytogenetic characteristics, populations of I. labrosus may show their own characteristics.(AU)

Foram realizadas análises citogenéticas em Iheringichthys labrosus do Rio Tibagi, Paraná, Brasil com a localização cromossômica dos DNAs ribossômicos 18S e 5S e a composição de bases de seus cromossomos B. As AgNORs foram observadas em posição terminal, no braço longo de um par de cromossomos subtelocêntricos. Marcações CMA3 positivas foram observadas em alguns cromossomos e associadas com as RONs. Porém, todas estas marcações apresentaram-se DAPI negativas. O cromossomo B mostrou-se fortemente fluorescente com CMA3. O uso concomitante das sondas de DNAr 18S e 5S, através da técnica de FISH, revelou os cístrons ribossômicos em um par de cromossomos subtelocêntricos, em posição terminal do braço longo, coincidindo com a AgNOR. Os sítios 5S foram observados em outro par subtelocêntrico, em posição intersticial do braço longo, próximo ao centrômero. Os resultados observados no presente estudo sugerem que, embora existam algumas características citogenéticas mais conservadas, as populações de I. labrosus podem mostrar suas próprias características.(AU)

Phenolic compounds and antifungal activity of ethyl acetate extract and methanolic extract from Capsicum chinense Jacq. ripe fruit

Abstract Food loss due to contamination caused by fungi has much impact on agriculture and leads to significant economic losses. Synthetic and natural fungicides have been used for avoiding losses of several food products due to fungal contamination. As a result, species of the genus Capsicum have been used for preserving food because of their chemical compounds with antifungal activity. Therefore, this study aimed at identifying some phenolic compounds found in both ethyl acetate extract (EAE) and methanolic extract (ME) from habanero pepper (C. chinense) ripe fruit by liquid chromatography tandem mass spectrometry with electrospray ionization (LC-ESI-MS/MS) and at evaluating their antifungal activities against fungi Sclerotinia sclerotiorum, Rhizopus stolonifer and Colletotrichum gloeosporioides. Extracts resulted from a sequential process of maceration. Antifungal activity was evaluated by the disk diffusion method (DDM) at the following doses of both diluted extracts: 25 µL, 50 µL, 100 µL and 200 µL. The chemical analysis showed that there were protocatechuic acid, gentisic acid, vanillic acid, kaempferol-3-O-robinobiosideo and naringenin in both extracts. EAE showed high inhibition of mycelial growth at both doses 100µL and 200µL against the three fungi while methanolic exhibited weak activity even at the highest dose under investigation. However, further in-depth studies are needed to reinforce their uses and practical applications to the agricultural field.

Resumo As perdas de alimentos por contaminação causada por fungos são de grande impacto negativo para a agricultura, gerando altos prejuízos econômicos. Para evitar as perdas de diversos produtos alimentícios pela contaminação fúngica são utilizados fungicidas sintéticos e naturais. As espécies do gênero Capsicum são usadas há muitos anos para auxiliar na conservação de alimentos por possuírem substâncias químicas com ação antifúngica entre outras. Neste contexto, o objetivo deste estudo foi identificar alguns compostos fenólicos por cromatografia líquida de alta eficiência acoplada à espectrometria de massas sequencial (LC-ESI-MS/MS) presentes nos extratos acetato de etila (EAE) e metanólico (ME) dos frutos maduros da pimenta biquinho (C. chinense) e avaliar atividade antifúngica de EAE e ME contra os fungos Sclerotinia sclerotiorum, Rhizopus stolonifer e Colletotrichum gloeosporioides. Os extratos foram obtidos de forma sequencial, utilizando o procedimento de maceração. A atividade antifúngica foi avaliada seguindo a metodologia de difusão em disco, nas doses de 25 µL, 50 µL, 100 µL e 200 µL de cada extrato diluído. A análise química evidenciou a presença de ácido protocatequico, ácido gentisico, ácido vanílico, kaempferol-3-O-robinobiosídeo e naringenina em ambos os extratos. EAE revelou maior poder de inibição do crescimento micelial nas doses de 100µL e 200µL contra os três fungos testados, enquanto ME exibiu fraca atividade inclusive na maior dose investigada. Entretanto, estudos mais aprofundados ainda são necessários para consolidar seu uso e aplicação prática na área agronômica.

Phenolic compounds and antifungal activity of ethyl acetate extract and methanolic extract from Capsicum chinense Jacq. ripe fruit / Compostos fenólicos e atividade antifúngica dos extratos acetato de etila e metanólico dos frutos maduros de Capsicum chinense Jacq

Food loss due to contamination caused by fungi has much impact on agriculture and leads to significant economic losses. Synthetic and natural fungicides have been used for avoiding losses of several food products due to fungal contamination. As a result, species of the genus Capsicum have been used for preserving food because of their chemical compounds with antifungal activity. Therefore, this study aimed at identifying some phenolic compounds found in both ethyl acetate extract (EAE) and methanolic extract (ME) from habanero pepper (C. chinense) ripe fruit by liquid chromatography tandem mass spectrometry with electrospray ionization (LC-ESI-MS/MS) and at evaluating their antifungal activities against fungi Sclerotinia sclerotiorum, Rhizopus stolonifer and Colletotrichum gloeosporioides. Extracts resulted from a sequential process of maceration. Antifungal activity was evaluated by the disk diffusion method (DDM) at the following doses of both diluted extracts: 25 µL, 50 µL, 100 µL and 200 µL. The chemical analysis showed that there were protocatechuic acid, gentisic acid, vanillic acid, kaempferol-3-O-robinobiosideo and naringenin in both extracts. EAE showed high inhibition of mycelial growth at both doses 100µL and 200µL against the three fungi while methanolic exhibited weak activity even at the highest dose under investigation. However, further in-depth studies are needed to reinforce their uses and practical applications to the agricultural field.

As perdas de alimentos por contaminação causada por fungos são de grande impacto negativo para a agricultura, gerando altos prejuízos econômicos. Para evitar as perdas de diversos produtos alimentícios pela contaminação fúngica são utilizados fungicidas sintéticos e naturais. As espécies do gênero Capsicum são usadas há muitos anos para auxiliar na conservação de alimentos por possuírem substâncias químicas com ação antifúngica entre outras. Neste contexto, o objetivo deste estudo foi identificar alguns compostos fenólicos por cromatografia líquida de alta eficiência acoplada à espectrometria de massas sequencial (LC-ESI-MS/MS) presentes nos extratos acetato de etila (EAE) e metanólico (ME) dos frutos maduros da pimenta biquinho (C. chinense) e avaliar atividade antifúngica de EAE e ME contra os fungos Sclerotinia sclerotiorum, Rhizopus stolonifer e Colletotrichum gloeosporioides. Os extratos foram obtidos de forma sequencial, utilizando o procedimento de maceração. A atividade antifúngica foi avaliada seguindo a metodologia de difusão em disco, nas doses de 25 µL, 50 µL, 100 µL e 200 µL de cada extrato diluído. A análise química evidenciou a presença de ácido protocatequico, ácido gentisico, ácido vanílico, kaempferol-3-O-robinobiosídeo e naringenina em ambos os extratos. EAE revelou maior poder de inibição do crescimento micelial nas doses de 100µL e 200µL contra os três fungos testados, enquanto ME exibiu fraca atividade inclusive na maior dose investigada. Entretanto, estudos mais aprofundados ainda são necessários para consolidar seu uso e aplicação prática na área agronômica.

IDENTIFICAÇÃO DO SEXO DE GANSOS DOMÉSTICOS (ANSER ANSER): COMPARAÇÃO DA TÉCNICA DE SEXAGEM CROMOSSÔMICA E A INSPEÇÃO PÓS-ANESTÉSICA DA CLOACA

Os gansos domésticos utilizados neste experimento eram de vida livre, pertencentes a um lago localizado em uma área urbana e sua população havia aumentado dramaticamente. a necessidade de um projeto com foco na esterilização de alguns machos, para reduzir o crescimento populacional, levou à necessidade de sexagem desses animais. como os gansos domésticos apresentam mínimo dimorfismo sexual, duas técnicas foram testadas: análise citogenética e inspeção da cloaca pós-anestesia. foram utilizados oito gansos adultos, escolhidos aleatoriamente de um grupo de 80 animais. eles foram capturados com redes ou manualmente, transportados individualmente e alojados em local apropriado a espera da análise citogenética (três a quatro dias). para a sexagem cromossomal, foram coletados 2 ml de sangue e a técnica de cultura de linfócitos periféricos foi empregada. as amostras resultantes foram tratadas com kcl hipotônico, fixadas em três trocas de solução de metanol e ácido acético. as lâminas foram preparadas com a técnica padrão e examinadas ao microscópio óptico para observação das metáfases. para a técnica de eversão da cloaca, foi realizada a anestesia injetável com tiletamina-zolazepam 5%. dez minutos após a anestesia, a cloaca foi evertida para a visualização das estruturas internas e a determinação sexual. As técnicas foram conduzidas em duplo cego, para melhor acurácia dos resultados. D