Resumo
A vitrificação de folículos secundários isolados pode ser uma opção eficiente para a preservação da fertilidade de mulheres tratadas e curadas de certos tipos de câncer que oferecem o risco de reintrodução de células malignas após o transplante de tecido ovariano. O objetivo dessa dissertação foi avaliar a morfologia, viabilidade e desenvolvimento folicular (crescimento e formação de antro), bem como investigar as proteínas relacionadas com a função esteroidogênica (aromatase) e com o remodelamento da membrana basal [metaloproteinases 2 (MMP-2) e 9 (MMP-9)] em folículos secundários após vitrificação e cultivo in vitro (CIV). Para isso, o córtex ovariano foi fragmentado e folículos secundários foram mecanicamente isolados. Imediatamente após o isolamento, parte dos folículos frescos foram fixados em paraformaldeído a 4% e destinados à imunomarcação para a aromatase e às MMPs-2 e 9. Os demais folículos foram distribuídos aleatoriamente em dois grupos: folículos secundários frescos (FSF) e folículos secundários vitrificados (VSF), ambos seguido do CIV por 6 ou 12 dias. Ao final do D6 e D12 de cultivo os FSF e VSF foram submetidos às análises de morfologia, viabilidade (azul de trypan), formação de antro, diâmetro folicular e oocitário. Além disso, a aromatase e as metaloproteinases também foram investigadas nos dois grupos de folículos (FSF e VSF). Nossos resultados mostraram que a vitrificação reduziu significativamente o percentual de folículos intactos após CIV, comparado aos FSF. O diâmetro folicular e oocitário dos VSF foi inferior (P < 0,05) ao dos FSF em ambos os dias de CIV. Os VSF apresentaram redução da viabilidade entre os dias 6 e 12 de cultivo, no entanto não foram observadas diferenças significativas em comparação aos FSF em ambos os dias. A formação de antro nos VSF foi inferior (P < 0,05) à dos FSF, no entanto, foi observado um aumento desse percentual de 6 para 12 dias em ambos os grupos de folículos. Além disso, os resultados mostraram que nos dias 6 e 12 a imunomarcação para a aromatase nas células da granulosa (GC) dos FSF foi forte e moderada, respectivamente, enquanto que nos VSF foi, respectivamente, moderada e forte. Quanto às MMPs, foi observada marcação moderada para as MMP-2 e MMP-9 nas GC dos FSF e VSF em ambos os dias de cultivo, exceto nos FSF no D6, que apresentaram marcação forte para MMP-9. Em conclusão, folículos secundários vitrificados são capazes de crescer e se desenvolver durante 12 dias de cultivo in vitro. Os folículos também mostraram evidências da sua capacidade esteroidogênica e de remodelamento da membrana basal, as quais são importantes para o desenvolvimento folicular.
The vitrification of secondary follicles can be an efficient option for preserving the fertility of women treated and cured of certain types of cancer that offer the risk of reintroduction of malignant cells after the transplantation of ovarian tissue. The objective of this dissertation was to evaluate the morphology, viability, and follicular development (growth and formation of antrum), as well as to investigate how proteins related to the steroidogenic function (aromatase) and the remodeling of the basement membrane [metalloproteinases 2 (MMP-2) and 9 (MMP-9)] in secondary follicles after vitrification and in vitro culture (IVC). For this, the ovarian cortex was fragmented and secondary follicles were mechanically isolated. Immediately after isolation, part of the fresh follicles were fixed in 4% paraformaldehyde and destined for immunostaining for aromatase and MMPs-2 and 9. The other follicles were randomly distributed in two groups: fresh secondary follicles (FSF) and vitrified secondary follicles (VSF), both followed by IVC for 6 or 12 days. At the end of D6 and D12 of culture, the FSF and VSF were submitted to morphology, viability (trypan blue), antrum formation, follicular, and oocyte diameter. In addition, aromatase and metalloproteinases were also investigated in the two groups of follicles (FSF and VSF). Our results showed that vitrification significantly reduced the percentage of intact follicles after IVC, compared to FSF. The follicular and oocyte diameter of the VSF was lower (P <0.05) than that of the FSF on both days of VSD. VSF showed a reduction in viability between days 6 and 12 of culture, however, no significant differences were observed in comparison to FSF on both days. Antrum formation in the VSF was lower (P <0.05) than in the FSF, however, an increase of this percentage was observed from 6 to 12 days in both groups of follicles. Furthermore, the results showed that on days 6 and 12 the immunostaining for aromatase in granulosa (GC) cells of the FSF was strong and moderate, respectively, whereas in the VSF it was, respectively, moderate and strong. As for MMPs, moderate marking was observed for MMP-2 and MMP-9 in the FSF and VSF GCs on both days of cultivation, except for the FSF in D6, which showed strong marking for MMP-9. In conclusion, vitrified secondary follicles can grow and develop during 12 days of in vitro culture. The follicles also showed evidence of their steroidogenic capacity and remodeling of the basement membrane, which is important for follicular development.