Inhibitory activities of propolis, nisin, melittin and essential oil compounds on Paenibacillus alvei and Bacillus subtilis

Background: Natural products represent important sources of antimicrobial compounds. Propolis and compounds from essential oils comprise good examples of such substances because of their inhibitory effects on bacterial spores, including bee pathogens. Methods: Ethanol extracts of propolis (EEP) from Apis mellifera were prepared using different methods: double ultrasonication, double maceration and maceration associated with ultrasonication. Together with the antimicrobial peptides nisin and melittin, and compounds present in the essential oils of clove (Syzygium aromaticum) and cinnamon (Cinnamomum zeylanicum), assays were carried out on one Bacillus subtilis isolate and Paenibacillus alvei (ATCC 6344) against vegetative and sporulated forms, using the resazurin microtiter assay. Synergism with all the antimicrobials in association with tetracycline was verified by the time-kill curve method. Potassium and phosphate efflux, release of proteins and nucleic acids were investigated. Results: EEPs showed the same MIC, 156.25 µg/mL against B. subtilis and 78.12 µg/mL against P. alvei. The peptides showed better activities against B. subtilis (MIC of 12 µg/ mL for melittin and 37.50 µg/mL for nisin). Antimicrobials showed similar inhibitory effects, but cinnamaldehyde (39.06 µg/mL) showed the best action against P. alvei. Melittin and nisin showed the greatest capacity to reduce spores, regarding B. subtilis there was a 100% reduction at 6.25 and 0.78 µg/mL, respectively. Concerning P. alvei, the reduction was 93 and 98% at concentrations of 80 µg/mL of melittin and 15 µg/ mL of nisin. EEPs showed the highest effects on the protein release against B. subtilis and P. alvei. Nucleic acid release, phosphate and potassium efflux assays indicated bacterial cell membrane damage. Synergism between antimicrobials and tetracycline was demonstrated against both bacteria. Conclusion: All antimicrobials tested showed antibacterial activities against vegetative and sporulated forms of P. alvei and B. subtilis, especially nisin and melittin. Synergism with tetracycline and damage on bacterial cell membrane also occurred.(AU)

Qualidade microbiológica de alimentos da culinária japonesa vendidos em restaurantes em Botucatu, SP / Microbiological quality of japanese cuisine foods sold in restaurants in Botucatu, SP

Verificamos a qualidade microbiológica de alimentos da culinária japonesa comercializados em restaurantes de Botucatu/SP. Foram analisadas 70 amostras coletadas em 14 restaurantes, em busca de Bacillus cereus, Staphylococcus aureus, Vibrio parahaemolyticus, Salmonella e coliformes termotolerantes (CT). Isolados de S. aureus foram investigados quanto à presença de genes que codificam a produção de biofilme (bap, icaA e icaD) e algumas enterotoxinas (sea-sei). A formação de biofilme in vitro foi testada. Das 70 amostras, 50 (71,4%) apresentaram CT e 27 (38,6%) eram impróprias para consumo. Salmonella, V. parahaemolyticus e B. cereus não foram detectados. S. aureus foi observado em 5 (7,1%) amostras. Os genes clássicos de enterotoxinas não foram detectados. O gene seh foi observado em 2 isolados, enquanto seg e sei estiveram presentes outros 2 isolados. Todas as cepas de S. aureus foram produtoras moderadas de biofilme. O gene icaD estava presente em todos os isolados e o icaA em 40%. Devido à presença de CT, indicador de contaminação fecal, e S. aureus, indicador de falta de higiene durante o manuseio, a comida japonesa comercializada em Botucatu-SP não pode ser considerada segura para consumo.(AU)

We verified the microbiological quality of Japanese cuisine foods sold in restaurants in Botucatu/SP. Seventy samples collected from 14 restaurants were analyzed, searching for Bacillus cereus Staphylococcus aureus, Vibrio parahaemolyticus, Salmonella and thermotolerant coliforms (TC). S. aureus isolates were investigated for the presence of genes encoding the biofilm production (bap, icaA and icaD) and some enterotoxins (sea-sei). The biofilm formation in vitro was tested. Considering the 70 samples, 50 (71.4%) had TC, and 27 (38.6%) were unfit for consumption. Salmonella, V. parahaemolyticus and B. cereus were not detected. S. aureus was observed in 5 (7.1%) samples. The classical enterotoxin genes were not detected. The seh gene was observed in 2 isolates, while both seg and sei were present in more 2 isolates. All strains of S. aureus were moderate producers of biofilm. The icaD gene was present in all isolates and icaA in 40%. Due to the presence of TC, an indicator of fecal contamination and S. aureus, also an indicator of poor hygiene during handling, Japanese food sold in Botucatu-SP cannot be considered safe for consumption.(AU)

Influence of seasonality and production method on the antibacterial activity of propolis / Influência da sazonalidade e método de produção na atividade antibacteriana da própolis

The antibacterial activity of propolis produced throughout the year by different methods of collection (‘intelligent’ collector of propolis - ICP; plastic screen - PC; conventional scraping - CS) on Staphylococcos aureus and Escherichia coli is investigated. Fifteen beehives (five per collector) of Africanized Apis mellifera were used. Monthly produced propolis, with the same collection technique, was mixed for the preparation of the extract. The ethanol extract of propolis (EEP) was prepared at the ratio of 30% (30 g of propolis, completing the volume for 100 mL with ethanol 70%). Two microorganisms, a positive bacterium Gram Staphylococcus aureus and a negative bacterium Gram Escherichia coli, through the methodology of diffusion in agar, were used for the biological activity evaluation of EEP. Results show that propolis presented antibacterial activity, affected by seasonality and by collecting method.

O objetivo deste estudo foi investigar a atividade antibacteriana da própolis produzida ao longo do ano por diferentes métodos de coleta (coletor de própolis ‘inteligente’ – CPI, tela plástica – TP e raspagem convencional – RC) sobre Staphylococcos aureus e Escherichia coli. Foram utilizadas 15 colmeias de Apis mellifera africanizadas. Para o preparo do extrato, foi misturada a própolis produzida mensalmente pela mesma técnica de coleta. O EAP foi preparado na proporção de 30% (30 g de própolis completando o volume para 100 mL com etanol 70%). Para avaliação da atividade biológica do EAP, foram usados dois micro-organismos: uma bactéria gram positivia Staphylococcus aureus e uma gram negativa Escherichia coli, por meio da metodologia de difusão em ágar. Os resultados mostraram que a própolis apresenta atividade antibacteriana, sendo esta influenciada pela sazonalidade e método de colheita utilizado.

Influence of seasonality and production method on the antibacterial activity of propolis / Influência da sazonalidade e método de produção na atividade antibacteriana da própolis

The antibacterial activity of propolis produced throughout the year by different methods of collection (‘intelligent collector of propolis - ICP; plastic screen - PC; conventional scraping - CS) on Staphylococcos aureus and Escherichia coli is investigated. Fifteen beehives (five per collector) of Africanized Apis mellifera were used. Monthly produced propolis, with the same collection technique, was mixed for the preparation of the extract. The ethanol extract of propolis (EEP) was prepared at the ratio of 30% (30 g of propolis, completing the volume for 100 mL with ethanol 70%). Two microorganisms, a positive bacterium Gram Staphylococcus aureus and a negative bacterium Gram Escherichia coli, through the methodology of diffusion in agar, were used for the biological activity evaluation of EEP. Results show that propolis presented antibacterial activity, affected by seasonality and by collecting method.(AU)

O objetivo deste estudo foi investigar a atividade antibacteriana da própolis produzida ao longo do ano por diferentes métodos de coleta (coletor de própolis ‘inteligente CPI, tela plástica TP e raspagem convencional RC) sobre Staphylococcos aureus e Escherichia coli. Foram utilizadas 15 colmeias de Apis mellifera africanizadas. Para o preparo do extrato, foi misturada a própolis produzida mensalmente pela mesma técnica de coleta. O EAP foi preparado na proporção de 30% (30 g de própolis completando o volume para 100 mL com etanol 70%). Para avaliação da atividade biológica do EAP, foram usados dois micro-organismos: uma bactéria gram positivia Staphylococcus aureus e uma gram negativa Escherichia coli, por meio da metodologia de difusão em ágar. Os resultados mostraram que a própolis apresenta atividade antibacteriana, sendo esta influenciada pela sazonalidade e método de colheita utilizado.

Prevalence and phenotypic characterization of Enterococcus spp. isolated from food in Brazil

We evaluated the frequency of enterococci from food and found 95.2% of positivity, being E. faecium and E. faecalis the most frequent species. High-level streptomycin resistance was observed, as well as gelatinase and hemolysis activity, showing the potential role of environmental strains as reservoir of virulence and resistance traits.(AU)

Produção in vitro de biofilme por Staphylococcus spp. isolados de salgadinhos e lanches / In vitro biofilm production by Staphylococcus spp. strains isolated from finger-foods and snacks

Staphylococcus aureus is one of the most important food-borne pathogens, and although Brazilian Sanitation Surveillance Agency (ANVISA) does not specifically regards for coagulase-negative Staphylococcus (CNS) isolation from foods, it is known that this group of bacteria possesses genes associated with biofilm formation and enterotoxins production. In this context, the present study aimedat identifying the S. aureus and CNS in finger-foods and snacks samples, and to evaluate the ability ofthese strains to produce biofilm in vitro by means of two methodologies: Congo Red agar and polystyrene microplates cultures. Twenty-two staphylococcal isolates belonging to eight species were obtained from 122 finger-foods, sandwiches and ready-to-eat (RTE) food products. S. aureus, S. warneri and S. haemolyticus were the most frequent isolates. Biofilm production by Staphylococcus spp. was observed in seven (31.8 %) isolates by Congo Red agar technique and three (13.6 %) by polyestirene microplate methodology. There was no positive isolate biofilm producer by both methodologies. Despite the low number of isolates, a concordance of 59.1 % between the tests was found. The ability to produce biofilm is an important virulence factor in Staphylococcus spp., and it can support to define the role of CNS as food-borne pathogen.(AU)

Staphylococcus aureus é um dos principais causadores de doenças de origem alimentar e, embora a Agência Nacional de Vigilância Sanitária ANVISA não contemple especificamente a detecção de estafilococos coagulase-negativa (ECN) em alimentos, sabe-se que este grupo de bactérias apresenta genes responsáveis pela formação de biofilme e produção de enterotoxinas. No presente estudo foram identificados os S. aureus e ECN em amostras de salgados, e sua capacidade de produzir biofilme in vitro foi avaliada por duas metodologias: ágar vermelho Congo e placa de microtitulação de poliestireno. Vinte e dois isolados de Staphylococcus pertencentes a oito diferentes espécies foram obtidos de 122 salgados, sanduíches e lanches. S. aureus, S. warneri e S. haemolyticus foram as espécies mais frequentemente isoladas. A produção de biofilme foi verificada em sete (31,8 %) isolados pela técnica de ágar vermelho Congo e em três (13,6 %) em placa de microtitulação. Nenhum isolado foi considerado positivo em ambas as metodologias. Apesar do baixo número de isolados, houve concordância de 59,1 % entre os testes. A capacidade de produzir biofilme é importante fator de virulência para Staphylococcus spp. e a detecção destes isolados de amostras de alimentos pode ajudar a definir o papel dos ECN como agentes patogênicos transmitidos por alimentos.(AU)

Inhibitory effect of essential oils against Lactobacillus rhamnosus and starter culture in fermented milk during its shelf-life period

The use of essential oils in foods has attracted great interest, due to their antagonistic action against pathogenic microorganisms. However, this action is undesirable for probiotic foods, as products containing Lactobacillus rhamnosus. The aim of the present study was to measure the sensitivity profile of L. rhamnosus and a yogurt starter culture in fermented milk, upon addition of increasing concentrations of cinnamon, clove and mint essential oils. Essential oils were prepared by steam distillation, and chemically characterised by gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS) and determination of density. Survival curves were obtained from counts of L. rhamnosus and the starter culture (alone and in combination), upon addition of 0.04% essential oils. In parallel, titratable acidity was monitored over 28 experimental days. Minimum inhibitory concentration values, obtained using the microdilution method in Brain Heart Infusion medium, were 0.025, 0.2 and 0.4% for cinnamon, clove and mint essential oils, respectively. Cinnamon essential oil had the highest antimicrobial activity, especially against the starter culture, interfering with lactic acid production. Although viable cell counts of L. rhamnosus were lower following treatment with all 3 essential oils, relative to controls, these results were not statistically significant; in addition, cell counts remained greater than the minimum count of 10(8)CFU/mL required for a product to be considered a probiotic. Thus, although use of cinnamon essential oil in yogurt makes starter culture fermentation unfeasible, it does not prevent the application of L. rhamnosus to probiotic fermented milk. Furthermore, clove and mint essential oil caused sublethal stress to L. rhamnosus.

Antibacterial activity of medicinal plant extracts

The present study aimed at evaluating the in vitro antimicrobial activity of methanolic extracts of some medicinal plants against Escherichia coli, Salmonella Typhimurium, Staphylococcus aureus and Enterococcus sp. The methanolic extract of Caryophyllus aromaticus presented the highest anti-S. aureus activity and was effective against all bacterial strains tested.

Avaliou-se a atividade antimicrobiana in vitro de extratos metanólicos de algumas plantas medicinais frente a Escherichia coli, Salmonella Typhimurium, Staphylococcus aureus e Enterococcus sp. O extrato metanólico de Caryophyllus aromaticus foi o mais eficaz para todas as bactérias testadas e apresentou a melhor atividade anti-S. aureus.

Atividade antimicrobiana de própolis de Apis mellifera obtidas em três regiões do Brasil

The antimicrobial activity of Apis mellifera propolis is widely reported, and the variations in this property according to the region where it was produced have been mentioned. Thus, the antimicrobial activity of propolis from three Brazilian regions (Botucatu, SP; Mossoró, RN and Urubici, SC) was investigated on isolated strains from human clinical material (Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Enterococcus sp, Pseudomonas aeruginosa, and Candida albicans). Ethanolic Extracts of Propolis (EEP) were prepared and the Minimal Inhibitory Concentration (MIC) was determined based on the method of EEP dilution in agar and the MIC90% calculated. Propolis from Botucatu was the most effective against S. aureus (0.3%v/v), Enterococcus sp (1.1%v/v), and C. albicans (2.1% v/v). The effective propolis against E. coli was from Urubici (7.0%v/v), and against P. aeruginosa, from Mossoró (5.3%v/v). The results shows that there are differences in the activity according to the region where the propolis were produced and Gram positive bacteria were more susceptible that Gram negative bacteria.

As propriedades biológicas da própolis de Apis mellifera são amplamente relatadas sendo comuns variações nas mesmas em função da região onde foram produzidas. A ação antimicrobiana de própolis obtidas em três regiões do Brasil (Botucatu-SP, Mossoró-RN e Urubici-SC) foi investigada sobre linhagens isoladas de infecções clínicas humanas (Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Enterococcus sp, Pseudomonas aeruginosa e Candida albicans). Foram preparados extratos alcoólicos de própolis (EAP) e determinada a Concentração Inibitória Mínima (CIM) seguida do cálculo da CIM90%. A própolis de Botucatu foi a mais eficiente sobre S. aureus (0,3%v/v), Enterococcus sp (1,1%v/v) e C. albicans (2,1% v/v). Para E. coli, a própolis eficiente foi de Urubici (7,0%v/v) e para P. aeruginosa a de Mossoró (5,3%v/v). Os resultados mostram maior sensibilidade das bactérias Gram positivas e levedura em relação às Gram negativas. É possível concluir que, para os microrganismos testados e amostras de própolis testadas, há diferenças na atividade antimicrobiana em função do local de produção e que isso se explica pela diferença de composição química da própolis.

Evaluation of the Diramic system for urine cultures

The use of the Diramic system in microbiological diagnosis of urinary tract infections (UTI) was evaluated. This system was developed at the National Center for Scientific Research of Cuba, and it reads turbidimetric changes of microbial growth in culture media at 37ºC incubated for 4 hours. A total of 396 urine specimens were tested in the Laboratory of Microbiology of the School of Medicine - UNESP, Brazil using the Diramic system and the counting of colony forming units per urine millimeter (calibrated loop) as the reference method. The coincidence rate between the two methods was 96.46% (382 urine samples), and the differences in results were not significant (p 0.05). Sensitivity and specificity rates were 84.37% and 98.80%, respectively. False negative and false positive rates were 2.50% and 1.01%, respectively. The microorganisms isolated from positive urines were: Escherichia coli (68.75%); Klebsiella pneumoniae (10.94%); yeast (6.25%); Pseudomonas aeruginosa (4.69%); Enterobacter cloacae (3.12%); Proteus mirabilis, coagulase negative Staphylococcus, Morganella morganii, and Citrobacter freundii (1.56% each). The Diramic system was effective as screening method for urine cultures, however restrictions in the UTI diagnosis caused by yeasts and patients undergoing antibiotic therapy were negative characteristics of the system.

O sistema Diramic foi avaliado para o diagnóstico das infecções do trato urinário (ITU). O sistema Diramic foi desenvolvido em Cuba e possibilita resultados de diagnóstico das infecções do trato urinário (ITU) em quatro horas e baseia-se na variação da turvação do crescimento microbiano no meio de cultura após incubação a 37ºC/4 horas. 396 amostras de urinas provenientes de ambulatórios e enfermarias do HC da FMB-UNESP-Botucatu/SP foram analisadas pelo sistema Diramic. O método da alça calibrada (AC) foi adotado como método de referência. A taxa de coincidência entre os dois métodos foi de 96,46% (382 amostras de urina), não havendo diferença significativa entre os resultados obtidos nos dois métodos. Os resultados para sensibilidade e especificidade foram 84,37 e 98,80% respectivamente e 10 resultados no Diramic foram falsos negativos (2,5%) e 4 falso positivos (1,01%). Os microrganismos identificados nas urinas positivas foram Escherichia coli (68,75%), Klebsiella pneumoniae (10,94%), leveduras (6,25%), Pseudomonas aeruginosa (4,69%), Enterobacter cloacae (3,12%) e Proteus mirabilis, Staphyloccocus coagulase negativo, Morganella morganii e Citrobacter freundii também foram identificadas (1,56% para cada espécie). O método Diramic foi eficiente na triagem das urinoculturas, porém verificou-se algumas restrições quanto ao diagnóstico das infecções do trato urinário quando causadas por leveduras e em pacientes submetidos a antibioticoterapia.

Synergistic effect of propolis and antibiotics on the Salmonella Typhi

The goal of this work was to investigate a possible synergistic effect between ethanolic extracts of propolis from Brazil and Bulgaria and some antibiotics (Amoxicillin, Ampicillin and Cefalexin) against Salmonella Typhi. Brazilian and Bulgarian propolis showed an antibacterial action, but the sample from Bulgaria was shown to be more efficient. Both samples showed a similar synergistic effect with these antibiotics. One may conclude that the propolis samples show an important antibacterial action, as well as a synergistic effect with antibiotics against Salmonella Typhi.

O objetivo do presente trabalho foi investigar um possível efeito sinérgico entre extrato alcoólico de própolis do Brasil e Bulgária com alguns antibióticos (Amoxilina, Ampicilina e Cefalexina) utilizados contra Salmonella Typhi. Própolis do Brasil e Bulgária mostraram uma atividade antibacteriana, embora a amostra da Bulgária tenha sido mais eficiente. Ambas as amostras apresentaram um efeito sinérgico com os antibióticos estudados. Pode-se concluir que as amostras de própolis possuem atividade antibacteriana, bem como apresentam efeito sinérgico com antibióticos utilizados contra Salmonella Typhi.

Atividade antimicrobiana de própolis de Apis mellifera obtidas em três regiões do Brasil

The antimicrobial activity of Apis mellifera propolis is widely reported, and the variations in this property according to the region where it was produced have been mentioned. Thus, the antimicrobial activity of propolis from three Brazilian regions (Botucatu, SP; Mossoró, RN and Urubici, SC) was investigated on isolated strains from human clinical material (Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Enterococcus sp, Pseudomonas aeruginosa, and Candida albicans). Ethanolic Extracts of Propolis (EEP) were prepared and the Minimal Inhibitory Concentration (MIC) was determined based on the method of EEP dilution in agar and the MIC90% calculated. Propolis from Botucatu was the most effective against S. aureus (0.3%v/v), Enterococcus sp (1.1%v/v), and C. albicans (2.1% v/v). The effective propolis against E. coli was from Urubici (7.0%v/v), and against P. aeruginosa, from Mossoró (5.3%v/v). The results shows that there are differences in the activity according to the region where the propolis were produced and Gram positive bacteria were more susceptible that Gram negative bacteria.

As propriedades biológicas da própolis de Apis mellifera são amplamente relatadas sendo comuns variações nas mesmas em função da região onde foram produzidas. A ação antimicrobiana de própolis obtidas em três regiões do Brasil (Botucatu-SP, Mossoró-RN e Urubici-SC) foi investigada sobre linhagens isoladas de infecções clínicas humanas (Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Enterococcus sp, Pseudomonas aeruginosa e Candida albicans). Foram preparados extratos alcoólicos de própolis (EAP) e determinada a Concentração Inibitória Mínima (CIM) seguida do cálculo da CIM90%. A própolis de Botucatu foi a mais eficiente sobre S. aureus (0,3%v/v), Enterococcus sp (1,1%v/v) e C. albicans (2,1% v/v). Para E. coli, a própolis eficiente foi de Urubici (7,0%v/v) e para P. aeruginosa a de Mossoró (5,3%v/v). Os resultados mostram maior sensibilidade das bactérias Gram positivas e levedura em relação às Gram negativas. É possível concluir que, para os microrganismos testados e amostras de própolis testadas, há diferenças na atividade antimicrobiana em função do local de produção e que isso se explica pela diferença de composição química da própolis.

Microbiological quality of finger food and snacks / Qualidade microbiológica de lanches e salgados

Although finger food is convenient, it may be easily contaminated from the stage of preparation to the moment of consumption. This study aimed at evaluating the microbiological quality of finger food and sandwiches sold in Botucatu SP, Brazil, by following the standards established by the Brazilian Health Surveillance Agency, ANVISA. The analysis was conducted according to APHA. A hundred and twenty-two samples of meat, chicken, shrimp, cheese, and vegetable finger food and sandwiches were tested from August 2008 to March 2009. Seventeen (13.9 %) samples of meat, cheese, vegetables and chicken were in disagreement with the ANVISA standards some of them in more than one parameter. High counting of thermotolerant coliforms and coagulase-positive staphylococci were found in ten (8.2 %) and eight (6.5 %) samples, respectively. Salmonella spp. was detected in two samples (1.6 %). No Bacillus cereus and sulfite-reducing clostridia were isolated. Although only 10 samples (8.2 %) showed pathogenic bacteria contamination, these results are relevant, since they indicate that the population is generally exposed to risks of acquiring foodborne diseases. Thus, the sanitary authorities might implement actions for supervising the quality of the food sold in Botucatu, and to strengthen the food sellers to improve the hygienic conditions and be aware of the risks of food contamination.

Neste trabalho foi avaliada a qualidade microbiológica de salgados e sanduíches comercializados em Botucatu-SP, seguindo-se a legislação em vigor. As análises foram realizadas de acordo com APHA. Foram analisadas 122 amostras de salgados de carne, frango, camarão, queijo e vegetais, e sanduíches no período de agosto/2008 a março/2009. Dezessete (13,9 %) amostras de carne, queijo, vegetais e frango, e em algumas em mais de um parâmetro, estavam em desacordo com a legislação em vigor. Foram detectadas elevadas contagens de coliformes termotolerantes e estafilococos coagulase-positiva, respectivamente, em dez (8,2 %) e oito (6,5 %) amostras. Salmonella spp. foi isolada em duas amostras (1,6 %). As contagens de Bacillus cereus e de Clostrídio Sulfito Redutor não ultrapassaram os padrões da legislação. A maioria dos salgados mostrou resultados dentro dos padrões estabelecidos pela legislação. A presença de bactérias patogênicas como S. aureus e Salmonella spp. foi demonstrada em 10 amostras (8,2 %); e este resultado é relevante, pois indica que a população está exposta a riscos de doenças veiculadas por alimentos. Torna-se necessário colocar em prática a vigilância dos alimentos comercializados em Botucatu, incentivar a melhoria de condições de higiene pelos comerciantes, e ter ciência dos riscos e das implicações da contaminação microbiológica dos alimentos.