Does supplementation of vitamin C, reduced glutathione or their association in semen extender reduce oxidative stress in bovine frozen semen? / A suplementação de vitamina C, glutationa reduzida ou sua associação no diluidor de sêmen reduz o estresse oxidativo no sêmen congelado bovino?

The aim of this study was to evaluate the addition of vitamin C, reduced glutathione and the association thereof to the bovine semen cryopreservation extender. The ejaculate from nine bulls were divided into four fractions, each corresponding to a treatment, namely: control group-semen diluted with Tris-yolk extender; vitamin C group-semen diluted in Tris-yolk extender supplemented with vitamin C (2.5mmol/mL); glutathione group-semen diluted in Tris-yolk extender supplemented with reduced glutathione (2.5mmol/mL) and associated group-semen diluted in Tris-yolk extender supplemented with vitamin C (1.25mmol/mL) and reduced glutathione (1.25mmol/mL). Afterwards, the semen was packed into French straws and submitted to cryopreservation using automated equipment. After cryopreservation, the semen was thawed and evaluated considering sperm motility, morphology, plasma membrane, acrosome, mitochondrial potential and oxidative stress, as well as the thermo resistance test. Extender's supplementation with the association of vitamin C and reduced glutathione showed benefic effects on sperm motility and preservation of plasma and acrosomal membranes during semen cryopreservation, being also the group that showed higher values of reactive oxygen species. Thus, the association of both antioxidants contributed to the preservation of sperm cells in every analyzed characteristic, suggesting its use on bovine semen cryopreservation.(AU)

O objetivo deste estudo foi avaliar a adição de vitamina C, glutationa reduzida e sua associação ao diluidor de criopreservação de sêmen bovino. O ejaculado de nove touros foi dividido em quatro frações, cada uma correspondendo a um tratamento, a saber: grupo controle - sêmen diluído em Tris-gema; grupo vitamina C - sêmen diluído em Tris-gema, suplementado com vitamina C (2,5mmol/mL); grupo glutationa - sêmen diluído em Tris-gema, suplementado com glutationa reduzida (2,5mmol/mL) e grupo sêmen associado - diluído em Tris-gema, suplementado com vitamina C (1,25mmol/mL) e glutationa reduzida (1,25mmol/mL ). Posteriormente, o sêmen foi envasado em palhetas francesas e submetido à criopreservação por meio de equipamento automatizado. Após a criopreservação, o sêmen foi descongelado e avaliado quanto à motilidade espermática, à morfologia, à membrana plasmática, ao acrossoma, ao potencial mitocondrial e ao estresse oxidativo, bem como pelo teste de resistência térmica. A suplementação de extensor com a associação de vitamina C e glutationa reduzida mostrou efeitos benéficos sobre a motilidade espermática e a preservação das membranas plasmática e acrossomal durante a criopreservação de sêmen, sendo também o grupo que apresentou maiores valores de espécies reativas de oxigênio. Assim, a associação de ambos os antioxidantes contribuiu para a preservação dos espermatozóides em todas as características analisadas, sugerindo sua utilização na criopreservação de sêmen bovino.(AU)

Does supplementation of vitamin C, reduced glutathione or their association in semen extender reduce oxidative stress in bovine frozen semen? / A suplementação de vitamina C, glutationa reduzida ou sua associação no diluidor de sêmen reduz o estresse oxidativo no sêmen congelado bovino?

The aim of this study was to evaluate the addition of vitamin C, reduced glutathione and the association thereof to the bovine semen cryopreservation extender. The ejaculate from nine bulls were divided into four fractions, each corresponding to a treatment, namely: control group-semen diluted with Tris-yolk extender; vitamin C group-semen diluted in Tris-yolk extender supplemented with vitamin C (2.5mmol/mL); glutathione group-semen diluted in Tris-yolk extender supplemented with reduced glutathione (2.5mmol/mL) and associated group-semen diluted in Tris-yolk extender supplemented with vitamin C (1.25mmol/mL) and reduced glutathione (1.25mmol/mL). Afterwards, the semen was packed into French straws and submitted to cryopreservation using automated equipment. After cryopreservation, the semen was thawed and evaluated considering sperm motility, morphology, plasma membrane, acrosome, mitochondrial potential and oxidative stress, as well as the thermo resistance test. Extender's supplementation with the association of vitamin C and reduced glutathione showed benefic effects on sperm motility and preservation of plasma and acrosomal membranes during semen cryopreservation, being also the group that showed higher values of reactive oxygen species. Thus, the association of both antioxidants contributed to the preservation of sperm cells in every analyzed characteristic, suggesting its use on bovine semen cryopreservation.(AU)

O objetivo deste estudo foi avaliar a adição de vitamina C, glutationa reduzida e sua associação ao diluidor de criopreservação de sêmen bovino. O ejaculado de nove touros foi dividido em quatro frações, cada uma correspondendo a um tratamento, a saber: grupo controle - sêmen diluído em Tris-gema; grupo vitamina C - sêmen diluído em Tris-gema, suplementado com vitamina C (2,5mmol/mL); grupo glutationa - sêmen diluído em Tris-gema, suplementado com glutationa reduzida (2,5mmol/mL) e grupo sêmen associado - diluído em Tris-gema, suplementado com vitamina C (1,25mmol/mL) e glutationa reduzida (1,25mmol/mL ). Posteriormente, o sêmen foi envasado em palhetas francesas e submetido à criopreservação por meio de equipamento automatizado. Após a criopreservação, o sêmen foi descongelado e avaliado quanto à motilidade espermática, à morfologia, à membrana plasmática, ao acrossoma, ao potencial mitocondrial e ao estresse oxidativo, bem como pelo teste de resistência térmica. A suplementação de extensor com a associação de vitamina C e glutationa reduzida mostrou efeitos benéficos sobre a motilidade espermática e a preservação das membranas plasmática e acrossomal durante a criopreservação de sêmen, sendo também o grupo que apresentou maiores valores de espécies reativas de oxigênio. Assim, a associação de ambos os antioxidantes contribuiu para a preservação dos espermatozóides em todas as características analisadas, sugerindo sua utilização na criopreservação de sêmen bovino.(AU)

Investigando a fragmentação não induzida e a susceptibilidade à fragmentação do DNA espermático: refinamento da avaliação espermática. Parte 2 / Investigating not induced fragmentation and susceptibility of sperm DNA: refinement of sperm evaluation. Second part

A integridade do DNA espermático está intimamente relacionada com a fertilidade. Técnicas queavaliam o DNA espermático possuem grande importância e potencial de serem aplicadas nas rotinas dasavaliações andrológicas. No entanto, são necessários maiores conhecimentos sobre as técnicas e seus princípiospara permitir que sejam empregadas apropriadamente de acordo com os objetivos e resultados esperados. Dessaforma, assim como abordado na Parte 1, nesta Parte 2 serão abordadas técnicas de avaliação do DNAespermático: TUNEL, laranja de acridina e Sperm Chromatin Structure Assay (SCSA). A técnica de TUNELfundamenta-se na adição de nucleotídeos modificados marcados com fluorescência às fitas fragmentadas. Atécnica avalia, portanto, diretamente a fragmentação de DNA da amostra. A sonda laranja de acridina é capaz dediferenciar, por meio de diferentes colorações, o DNA fragmentado do não fragmentado. Já a técnica de SCSAbaseia-se na imposição de um desafio ao espermatozoide; esta técnica avalia a susceptibilidade dosespermatozoides à fragmentação de DNA, sendo, portanto, uma avaliação indireta. A presente revisão permiteexpor a opinião dos autores sobre as diferentes técnicas e suas aplicações, mostrando o potencial emprego delasnos exames de rotina e nas pesquisas.(AU)

Sperm DNA integrity is directly related to male fertility. Techniques to assess sperm DNA are importantand have potential to be applied in routine evaluation of semen. However, the techniques and principles need tobe further studied to apply they correctly and to get relevant results. Thus, as discussed in Part 1, Part 2 willaddress evaluation techniques of sperm DNA: TUNEL, acridine orange and Sperm Chromatin Structure Assay(SCSA). TUNEL is based on addition of modified nucleotides labeled with fluorescence to fragmented tapesevaluating, therefore, directly, the DNA fragmentation of the sample. Acridine orange differentiates fragmentedDNA by different colors. On the other hand, SCSA are based on the imposition of a challenge to sperm. Thus,this technique assesses the susceptibility of sperm DNA fragmentation constituting indirect assessment. Thereview allows showing opinion of the authors about different techniques and their applications. Therefore,potential use of these techniques in routine exams and researches are addressed.(AU)

Investigando a compactação e a fragmentação não induzida do DNA espermático: refinamento da avaliação espermática parte 1 / Investigating condensation and not induced fragmentation of sperm DNA: Refinement of sperm evaluation first part

O DNA espermático possui papel essencial na reprodução, visto que danos no material genético podemprejudicar os processos de fecundação e desenvolvimento embrionário. Ademais, há evidências de que danos aoDNA podem ser causados por alterações epigenéticas. Entretanto, embora ainda não seja aplicada nas avaliaçõesandrológicas de rotina, faz-se essencial a avaliação do status de integridade do DNA espermático. Existemdiversas técnicas de avaliação com diferentes princípios e objetivos. A aplicação destas irá depender dosequipamentos disponíveis, do treinamento da equipe e das respostas a serem obtidas. Ainda, para a interpretaçãodos resultados obtidos, é necessário o conhecimento do princípio de análise de cada técnica. Assim, a presenterevisão, dividida em duas partes, tem por objetivo abordar diferentes técnicas de avaliação. As técnicasabordadas na parte 1 estão relacionadas às avaliações de compactação da cromatina (azul de toluidina, azul deanilina e cromomicina A3) e à avaliação direta da fragmentação de DNA (ensaio Cometa e teste de dispersão dacromatina modificado). Na parte 2, serão abordadas as técnicas de TUNEL, laranja de acridina e “SpermChromatin Structure Assay” (SCSA). Nesta revisão, serão abordados os princípios dos testes e a interpretaçãodos resultados baseados na literatura e nas pesquisas do grupo.(AU)

Sperm DNA has an important role on reproduction. Injuries in genetic material can impair thefertilization processes and embryonic development. Furthermore, there is evidence that DNA damage can becaused by epigenetic alterations. Although DNA evaluation in sperm analysis routine assessments is essential, itis not yet performed. There are numerous techniques of DNA evaluation with different principles and objectives.Application of these techniques will depend on the equipment available, the staff training and answers to berequired. To interpret the results, however, knowledge of each analysis technique is required. Therefore, thisreview, divided in two parts, aims to consider different techniques. The techniques that will be consideredthroughout the first part of review are: toluidine blue, aniline blue, A3 chromomycyn, Comet assay anddispersion test of modified chromatin. In the second part, it will be approached TUNEL, acridine orange andSperm Chromatin Structure Assay (SCSA) techniques. We will discuss the testes and the main results based onliterature and researches of our group.(AU)

Investigando a compactação e a fragmentação não induzida do DNA espermático: refinamento da avaliação espermática – parte 1 / Investigating condensation and not induced fragmentation of sperm DNA: Refinement of sperm evaluation – first part

O DNA espermático possui papel essencial na reprodução, visto que danos no material genético podemprejudicar os processos de fecundação e desenvolvimento embrionário. Ademais, há evidências de que danos aoDNA podem ser causados por alterações epigenéticas. Entretanto, embora ainda não seja aplicada nas avaliaçõesandrológicas de rotina, faz-se essencial a avaliação do status de integridade do DNA espermático. Existemdiversas técnicas de avaliação com diferentes princípios e objetivos. A aplicação destas irá depender dosequipamentos disponíveis, do treinamento da equipe e das respostas a serem obtidas. Ainda, para a interpretaçãodos resultados obtidos, é necessário o conhecimento do princípio de análise de cada técnica. Assim, a presenterevisão, dividida em duas partes, tem por objetivo abordar diferentes técnicas de avaliação. As técnicasabordadas na parte 1 estão relacionadas às avaliações de compactação da cromatina (azul de toluidina, azul deanilina e cromomicina A3) e à avaliação direta da fragmentação de DNA (ensaio Cometa e teste de dispersão dacromatina modificado). Na parte 2, serão abordadas as técnicas de TUNEL, laranja de acridina e “SpermChromatin Structure Assay” (SCSA). Nesta revisão, serão abordados os princípios dos testes e a interpretaçãodos resultados baseados na literatura e nas pesquisas do grupo.

Sperm DNA has an important role on reproduction. Injuries in genetic material can impair thefertilization processes and embryonic development. Furthermore, there is evidence that DNA damage can becaused by epigenetic alterations. Although DNA evaluation in sperm analysis routine assessments is essential, itis not yet performed. There are numerous techniques of DNA evaluation with different principles and objectives.Application of these techniques will depend on the equipment available, the staff training and answers to berequired. To interpret the results, however, knowledge of each analysis technique is required. Therefore, thisreview, divided in two parts, aims to consider different techniques. The techniques that will be consideredthroughout the first part of review are: toluidine blue, aniline blue, A3 chromomycyn, Comet assay anddispersion test of modified chromatin. In the second part, it will be approached TUNEL, acridine orange andSperm Chromatin Structure Assay (SCSA) techniques. We will discuss the testes and the main results based onliterature and researches of our group.

Investigando a fragmentação não induzida e a susceptibilidade à fragmentação do DNA espermático: refinamento da avaliação espermática. Parte 2 / Investigating not induced fragmentation and susceptibility of sperm DNA: refinement of sperm evaluation. Second part

A integridade do DNA espermático está intimamente relacionada com a fertilidade. Técnicas queavaliam o DNA espermático possuem grande importância e potencial de serem aplicadas nas rotinas dasavaliações andrológicas. No entanto, são necessários maiores conhecimentos sobre as técnicas e seus princípiospara permitir que sejam empregadas apropriadamente de acordo com os objetivos e resultados esperados. Dessaforma, assim como abordado na Parte 1, nesta Parte 2 serão abordadas técnicas de avaliação do DNAespermático: TUNEL, laranja de acridina e Sperm Chromatin Structure Assay (SCSA). A técnica de TUNELfundamenta-se na adição de nucleotídeos modificados marcados com fluorescência às fitas fragmentadas. Atécnica avalia, portanto, diretamente a fragmentação de DNA da amostra. A sonda laranja de acridina é capaz dediferenciar, por meio de diferentes colorações, o DNA fragmentado do não fragmentado. Já a técnica de SCSAbaseia-se na imposição de um desafio ao espermatozoide; esta técnica avalia a susceptibilidade dosespermatozoides à fragmentação de DNA, sendo, portanto, uma avaliação indireta. A presente revisão permiteexpor a opinião dos autores sobre as diferentes técnicas e suas aplicações, mostrando o potencial emprego delasnos exames de rotina e nas pesquisas.

Sperm DNA integrity is directly related to male fertility. Techniques to assess sperm DNA are importantand have potential to be applied in routine evaluation of semen. However, the techniques and principles need tobe further studied to apply they correctly and to get relevant results. Thus, as discussed in Part 1, Part 2 willaddress evaluation techniques of sperm DNA: TUNEL, acridine orange and Sperm Chromatin Structure Assay(SCSA). TUNEL is based on addition of modified nucleotides labeled with fluorescence to fragmented tapesevaluating, therefore, directly, the DNA fragmentation of the sample. Acridine orange differentiates fragmentedDNA by different colors. On the other hand, SCSA are based on the imposition of a challenge to sperm. Thus,this technique assesses the susceptibility of sperm DNA fragmentation constituting indirect assessment. Thereview allows showing opinion of the authors about different techniques and their applications. Therefore,potential use of these techniques in routine exams and researches are addressed.