Resumo
O objetivo do presente estudo foi o de testar o uso do programa de código aberto ImageJ (processador de imagens em plataforma Java) à campo, usando microscópio óptico e câmera de celular para avaliar a motilidade total e a concentração de sêmen equino. Para isso foi necessário utilizar um adaptador universal para smartphones e melhorar a qualidade das imagens e vídeos por meio de corte, remoção de fundo e uso da ferramenta threshold do ImageJ. Para a determinação da motilidade, foram utilizadas 70 amostras de sêmen equino, incluindo amstras refrigeradas (48) e congeladas (22) que tiveram seus valores de motilidade total comparados entre avaliação visual e plugin CASA do ImageJ (CASAF). As amostras congeladas (22), além de serem avaliadas por meio de análise visual e CASAF, foram avaliadas por um CASA comercial (CCASA). Os cálculos das comparações foram feitas com ANOVA, teste de correlação de Pearson e de Qui-quadrado, visando a detecção de erros do CASAF e análise visual em relação ao CCASA (considerando-se uma margem de 10,0%). A ANOVA não resultou em diferença estatística (P>0,05) para as 70 amostras comparadas entre CASAF (37,9±25,8) e entre os dois avaliadores experientes (37,6±25,0 e 37,5±25,5). A comparação das 22 amostras congeladas entre o CASAF (23,36±15,9), análise visual (25,5±18,8 e 25,8±18,5) e CCASA (25,2±18,3) também não resultou em diferença estatística. A média dos resultados obtidos com o CASAF subestimou a média obtida em relação ao CCASA em 7,2%. A correlação entre CASAF e o CCASA foi significativamente elevada (r=0,95, P<0,0001), bem como a correlação entre CASAF e análise visual (r=0,92, P<0,0001). Os testes de Qui-quadrado resultaram em proporção de acertos similares entre o CASAF e o CCASA (P=0,14), ao passo que a análise visual, resultou em proporções diferentes em comparação ao CCASA (P=0,04). Mesmo que haja uma diferença de algoritmo entre diferentes sistemas CASA, com o uso do CASAF à campo foi possível obter-se um valor de motilidade total muito próximo ao verificado em programas comerciais, tendo maior acurácia do que as análises visuais. Com referência à concentração do sêmen equino foram utilizadas 108 amostras à fresco, analisadas no hemocitômetro (câmara de Neubauer) e no programa de código aberto ImageJ (ImageJ), por meio de fotos da mesma câmara após a contagem. Dezenove dessas amostras foram também analisadas em um CCASA e comparadas aos demais métodos. As comparações foram feitas pelo teste de Friedman, de Dunn, teste t pareado, correlação de Pearson e Qui-quadrado (total e entre classes de concentração: <100, 100-200, 200-300 e >300 x106/mL), considerando-se como acertos, valores em uma margem de 10% do valor da Neubauer (padrão). Houve diferença nas médias de concentração do sêmen entre o CCASA (381,1±212,2) e Neubauer (239,4±180,3) demonstrada por teste de Dunn e teste t pareado, porém não houve diferença (Dunn) entre ImageJ (210,2±147) e Neubauer (206,1±143,7). Considerando a diferença média entre os métodos, o ImageJ superestimou a concentração obtida com a Neubauer em 1,9%, enquanto que o CCASA superestimou em 59,2%. A correlação entre ImageJ e Neubauer foi fortemente positiva (r=0,99; P<0,0001). A proporção de acertos, tanto de ImageJ como de CCASA, foi diferente (P<0,0001) em comparação à Neubauer. Ainda assim, ImageJ obteve 73% de acertos, e o CCASA somente 5,3%. Erros individuais do ImageJ comparado à Neubauer por classes foram significativos somente nos dois grupos com menores concentrações, sendo consistente com relatos de imprecisão dos métodos computadorizados para amostras com menor concentração celular. Já o CCASA obteve erros de superestimação significativos em todas as classes. Considerando a variação de contagem universalmente aceita da própria câmara de Neubauer, a diferença entre esse método e o ImageJ foi aceitável. Conclui-se que é possível analisar a motilidade total e a concentração de sêmen equino utilizando um microscópio óptico e uma câmera de celular, resultando em valores consistentes aos obtidos por métodos consagrados com baixo custo de equipamento.
The objective of this study was to test the use of the open source software ImageJ (image processor on Java platform) under field conditions, with light microscope and cell phone camera to evaluate total percent motility and concentration of equine semen. A smartphone adapter was attached to the eyepiece of the microscope, and images and videos needed previous enhancement, such as crop, background subtraction and threshold (ImageJ tools) to improve quality, which is indispensable for correct semen analysis. In the experiment of motility, 70 samples of equine semen, frozen (22) and cooled (48), had their total motility values compared between visual evaluation and ImageJ plugin (CASAF). The frozen samples (22), besides being evaluated by visual analysis and CASAF, were also evaluated by a commercial CASA (CCASA). Comparisons were made using ANOVA, Pearsons correlation and Chi-square test to compare errors of CASAF and visual analysis compared to CCASA, using a margin of 10%. ANOVA did not result in statistical difference (P> 0.05) between 70 samples analyzed with CASAF (37,9±25,8) and by two experienced technicians (37,6±25,0 and 37,5±25,5). The comparison of the 22 frozen samples between CASAF (23,36±15,9), visual analysis (25,5±18,8 e 25,8±18,5) and CCASA (25,2±18,3) did not result in statistical difference either. The average of results obtained with CASAF underestimated the average obtained with CCASA in 7,2%. The correlation between CASAF and CCASA was significantly high (r=0,95, P<0.0001), as well as the correlation between CASAF and visual analysis (r=0,92, P<0.0001). Chi-square analysis resulted in similar proportion of correct answers obtained with CASAF when compared to CCASA (P=0,14), while visual analysis had different proportion compared to CCASA (P=0,04). Even if there is a difference in algorithm of different CASA systems, it was possible to obtain values of total motility similar to the ones found in commercial programs using field conditions, being more accurate than visual analysis. In the experiment of sperm concentration 108 samples of fresh equine semen were analyzed with hemocytometer (Neubauer) and ImageJ (ImageJ), using photos of the same chamber, after perform counting. Nineteen of these samples were also analyzed in a CCASA and compared to the other methods. Comparisons were made using Friedman test, Dunn's test, paired t test, Pearsons correlation and Chi-square (total and within classes of concentration: <100, 100-200, 200-300 and >300 x106/mL), considering as correct, values within a margin of 10% of those obtained with Neubauer (standard). There was significant difference between CCASA (381,1±212,2) and Neubauer (239,4±180,3) averages, shown by Dunns and paired t test, but no difference (Dunns) between ImageJ (210,2±147) and Neubauer (206,1±143,7) averages was found. Considering average difference between methods, ImageJ overestimated concentration obtained with Neubauer in 1,9%, while CCASA overestimated in 59,2%. The correlation between ImageJ and Neubauer was highly positive (r=0,99, P<0,0001). Proportion of correct answers obtained with either ImageJ or CCASA was different (P<0,0001) from Neubauer. Still, ImageJ achieved 73% of correct answers and CCASA only 5,3%. Errors of ImageJ compared to Neubauer within classes were significant only in the two groups with lower concentration, corroborating reports of imprecision of computerized methods in low concentrated samples. CCASA obtained significant overestimation errors in all classes. Since there is a variation universally accepted in Neubauer chamber itself, the difference between this method and the ImageJ was acceptable. We conclude that it is possible to analyze total motility and concentration of equine semen with ImageJ using a light microscope and a cell phone camera, resulting in values close to those obtained by reliable methods with a low cost equipment.