Teste de ELISA indireto para o diagnóstico sorológico de pitiose / Indirect ELISA for the serodiagnostic of pythiosis

A pitiose, doença granulomatosa de eqüinos causada pelo oomiceto Pythium insidiosum, tem como característica a evolução rápida seguida de morte dos animais. Estas mortes muitas vezes são causadas por diagnósticos errôneos ou demorados quando os doentes já não respondem ao tratamento. Este trabalho teve por objetivo a padronização do ensaio imunoenzimático indireto (ELISA) para diagnóstico sorológico de pitiose em eqüinos e coelhos, visando a diminuição de erros e de tempo necessário para o diagnóstico. Para o desenvolvimento e validação do teste foram utilizadas 72 amostras de soro de eqüinos saudáveis e 44 soros de eqüinos com pitiose confirmada. Os resultados da validação do ELISA para eqüinos foram: sensibilidade 97,72 por cento, especificidade 90,27 por cento, valor preditivo positivo 86 por cento, valor preditivo negativo 98,4 por cento e eficiência de 93,1 por cento. Para coelhos, o teste foi padronizado com 48 amostras de soro de animais saudáveis e 24 amostras de coelhos imunizados com antígenos de P. insidiosum. Os resultados foram: sensibilidade 91,66 por cento, especificidade 95,83 por cento, valor preditivo positivo 91,66 por cento, valor preditivo negativo 95,83 por cento e eficiência de 94,44 por cento. Os resultados deste trabalho demonstram que o ensaio imunoenzimático indireto é um método seguro e eficaz para o diagnóstico sorológico da pitiose.(AU)

Pythiosis is a granulomatous disease caused by the oomycete Pythium insidiosum that affects humans and animals, especially horses. Deaths are very often the consequence of incorrect or late diagnosis when animals no longer respond to treatment. This study aimed standardization of the ELISA assay for the serodiagnostic of pythiosis in horses and rabbits, in order to minimize errors and delays in the diagnosis of the disease. Sera of 72 healthy and 44 of by pythiosis affected horses were used for development and evaluation of the test. The ELISA for equine diagnostic showed 97.72% sensitivity, 90.27% specificity, 86% positive predictive value, 98.4% negative predictive value, and 93.1% efficiency. The rabbit test was standardized with 48 sera of healthy rabbits and 24 sera of rabbits immunized with P. insidiosum antigens. The results were 91.66 % sensitivity, 95.83% specificity, 91.66% positive predictive value, 95.83% negative predictive value, and 94.44% efficiency. It can be concluded that ELISA is a reliable test for diagnostic and serological monitoring of pythiosis.(AU)

Resposta sorológica de coelhos imunizados com antígenos de Pythium insidiosum associados a diferentes adjuvantes

Pythium insidiosum is a zoosporic fungi living in flooded areas which can infect humans and animals. Natural infection in these species results in clinical pythiosis, a granulomatous disease of difficult treatment. Immunotherapy with antigens obtained from cultures of the agent is a promising alternative therapy. In order to evaluate the effect of adjuvants in the immunologic response to P. insidiosum antigens, 24 rabbits were assigned to four groups and immunized with mycelian mass antigen with each of there adjuvants. Group I: aluminum hydroxide; group II: Freunds adjuvant; group III: mineral oil and group IV: distilled water-control. The effects of the adjavants were evaluated by measuring the levels of anti-pythium imunoglobulin G (IgG) produced by the immunized rabbits at different time-points after immunization, using an ELISA test. During phase 1, the animals were immunized three times (days zero, 14 and 28) and serologically tested at days 14, 21, 28 and 35. The oil adjuvants (groups II and III) were statistically superior to groups I and IV. During phase 2 (from day 42 to 120) each group was subdivided in two, with one subgroup having additional immunizations at days 42, 56, 68 and 82 and the other having the treatment interrupted. Among the rabbits with continued immunizations, groups I, II and III (adjuvants) had statistically higher IgG levels than GIV. Among rabbits with interrupted treatment, GI, GII and presented stable IgG levels and were statistically superior to the control group, that presented decrease in the levels. These results demonstrated that the adjuvants were capable of inducing stronger and longer imunologic responses (IgG) to P. insidiosum antigens. Therefore, the use of adjuvants associated with P. insidiosum antigens may increase the recovery rates obtained through immunotherapy.

O Pythium insidiosum é um fungo zoospórico que se desenvolve em locais alagadiços e que pode infectar humanos e animais, principalmente eqüinos. A infecção natural nesta espécie resulta em pitiose clínica, uma doença granulomatosa de difícil tratamento. Uma das opções terapêuticas é a imunoterapia com antígenos obtidos de culturas do agente. Com o objetivo de avaliar o efeito de adjuvantes na resposta sorológica a antígenos do P. insidiosum, 24 coelhos divididos em 4 grupos foram imunizados com antígeno macerado de micélio (AMM) associado a três adjuvantes. Grupo I: hidróxido de alumínio; grupo II: adjuvante de Freund; grupo III: óleo mineral e grupo IV: água destilada -controle. Os tratamentos foram avaliados a diferentes intervalos, quanto à capacidade de induzir a produção de imunoglobulinas específicas da classe G, através da técnica de ELISA. Na fase 1, os animais receberam três doses do imunógeno (dias zero, 14 e 28) e foram avaliados sorologicamente nos dias 14, 21, 28 e 35. Nessa fase, os adjuvantes oleosos (GII e III) induziram níveis de anticorpos estatisticamente superiores aos induzidos nos grupos I e IV. Durante a fase 2 (dias 42 a 120), cada grupo foi subdividido em dois; sendo um subgrupo mantido em tratamento (imunizações adicionais nos dias 42, 56, 68 e 82) e o outro tendo o tratamento interrompido após a 3ª dose (dia 28). Nos subgrupos mantidos em tratamento, os níveis de anticorpos dos grupos imunizados com adjuvantes foram estatisticamente superiores aos induzidos no grupo GIV (controle). Nos coelhos com tratamento interrompido, os grupos I, II e III apresentaram manutenção nos níveis de IgG e foram estatisticamente superiores ao grupo controle, que apresentou declínio nos níveis de anticorpos. Os resultados demonstraram a capacidade dos adjuvantes testados em potencializar e prolongar a resposta humoral aos antígenos do P. insidiosum. O uso de adjuvantes associado aos atuais imunógenos pode aumentar os índices de cura em eqüinos submetidos à imunoterapia, assim como viabilizar sua utilização como preventivo.

Different culture media applied to the study of Cryptococcus neoformans susceptibility to amphotericin B and fluconazole

This study compared the performance of three culture media used for the determination of minimal inhibitory concentration (MIC) of amphotericin B and fluconazole against 48 Cryptococcus neoformans strains. For amphotericin B the media employed were RPMI 1640 medium, as indicated by NCCLS as reference, Yeast Nitrogen Base (YNB) as proposed by Ghannoum et al. (YNB-1), Antibiotic medium 3 (AM3) indicated by others, and YNB as proposed by us (YNB-2). In YNB-1, amphotericin B showed broader MIC ranges, varying from 0.125 µg/ml to 1.0 µg/ml; in RPMI 1640 medium and YNB-2 the MICs were similar and in AM3 the MIC ranges were narrower. The same pattern was observed for MIC 90%. For fluconazole the media employed were RPMI 1640 and YNB-1. The MIC ranges were broader and elevated when YNB-1 was employed. MIC 50% were 2.0 µg/ml in RPMI 1640 medium and 4.0 µg/ml in YNB-1. Our results indicate that RPMI 1640 supplemented with 2% glucose allowed a good growth at 48h; YNB as recommended by Ghannoum et al. provided a broader MIC range, AM3 provided a narrow MIC range for amphotericin B, and YNB-2 was very similar to RPMI 1640 medium.

Comparou-se o desempenho de três meios de cultura na determinação das concentrações inibitórias mínimas (CIMs) de dois antifúngicos frente a 48 amostras de C. neoformans. Para anfotericina B, os meios empregados foram o Caldo RPMI 1640, indicado como referência pelo NCCLS, o Yeast Nitrogen Base (YNB-1) indicado por Ghannoum et al., o Antibiotic Medium 3 (AM3) utilizado por vários autores e o YNB-2, sugerido por nós, que é o mesmo YNB-1, todavia, adequado à técnica preconizada pelo NCCLS. Para a anfotericina B, a mais ampla faixa de CIMs (0,125-1,0 mg/ml) foi obtida no YNB-1; os intervalos de CIMs obtidos no caldo RPMI 1640 e no YNB-2 foram muito similares enquanto que o AM3 evidenciou pequenas variações nas CIMs. Para os testes com o fluconazol utilizou-se o RPMI 1640 e o YNB-1; novamente, o mais amplo intervalo de CIMs, assim como as CIMs mais elevadas, foram observados no YNB-1; as variações de CIM 50% foram de 2,0 mg/ml no RPMI 1640 e 4,0 mg/ml no YNB-1. Os resultados obtidos permitem concluir que: o RPMI 1640 suplementado com dextrose 2% permite um bom crescimento em 48h de incubação; o YNB recomendado por Ghannoum et al. fornece faixas de CIMs mais amplas; que o AM3 forneceu estreito intervalo de CIMs para a anfotericina B e que o YNB-2 utilizado nos testes com anfotericina B, evidenciou resultados muito semelhantes aos do caldo RPMI 1640.

Resposta sorológica de coelhos imunizados com antígenos de Pythium insidiosum associados a diferentes adjuvantes

Pythium insidiosum is a zoosporic fungi living in flooded areas which can infect humans and animals. Natural infection in these species results in clinical pythiosis, a granulomatous disease of difficult treatment. Immunotherapy with antigens obtained from cultures of the agent is a promising alternative therapy. In order to evaluate the effect of adjuvants in the immunologic response to P. insidiosum antigens, 24 rabbits were assigned to four groups and immunized with mycelian mass antigen with each of there adjuvants. Group I: aluminum hydroxide; group II: Freund’s adjuvant; group III: mineral oil and group IV: distilled water-control. The effects of the adjavants were evaluated by measuring the levels of anti-pythium imunoglobulin G (IgG) produced by the immunized rabbits at different time-points after immunization, using an ELISA test. During phase 1, the animals were immunized three times (days zero, 14 and 28) and serologically tested at days 14, 21, 28 and 35. The oil adjuvants (groups II and III) were statistically superior to groups I and IV. During phase 2 (from day 42 to 120) each group was subdivided in two, with one subgroup having additional immunizations at days 42, 56, 68 and 82 and the other having the treatment interrupted. Among the rabbits with continued immunizations, groups I, II and III (adjuvants) had statistically higher IgG levels than GIV. Among rabbits with interrupted treatment, GI, GII and presented stable IgG levels and were statistically superior to the control group, that presented decrease in the levels. These results demonstrated that the adjuvants were capable of inducing stronger and longer imunologic responses (IgG) to P. insidiosum antigens. Therefore, the use of adjuvants associated with P. insidiosum antigens may increase the recovery rates obtained through immunotherapy.

O Pythium insidiosum é um fungo zoospórico que se desenvolve em locais alagadiços e que pode infectar humanos e animais, principalmente eqüinos. A infecção natural nesta espécie resulta em pitiose clínica, uma doença granulomatosa de difícil tratamento. Uma das opções terapêuticas é a imunoterapia com antígenos obtidos de culturas do agente. Com o objetivo de avaliar o efeito de adjuvantes na resposta sorológica a antígenos do P. insidiosum, 24 coelhos divididos em 4 grupos foram imunizados com antígeno macerado de micélio (AMM) associado a três adjuvantes. Grupo I: hidróxido de alumínio; grupo II: adjuvante de Freund; grupo III: óleo mineral e grupo IV: água destilada -controle. Os tratamentos foram avaliados a diferentes intervalos, quanto à capacidade de induzir a produção de imunoglobulinas específicas da classe G, através da técnica de ELISA. Na fase 1, os animais receberam três doses do imunógeno (dias zero, 14 e 28) e foram avaliados sorologicamente nos dias 14, 21, 28 e 35. Nessa fase, os adjuvantes oleosos (GII e III) induziram níveis de anticorpos estatisticamente superiores aos induzidos nos grupos I e IV. Durante a fase 2 (dias 42 a 120), cada grupo foi subdividido em dois; sendo um subgrupo mantido em tratamento (imunizações adicionais nos dias 42, 56, 68 e 82) e o outro tendo o tratamento interrompido após a 3ª dose (dia 28). Nos subgrupos mantidos em tratamento, os níveis de anticorpos dos grupos imunizados com adjuvantes foram estatisticamente superiores aos induzidos no grupo GIV (controle). Nos coelhos com tratamento interrompido, os grupos I, II e III apresentaram manutenção nos níveis de IgG e foram estatisticamente superiores ao grupo controle, que apresentou declínio nos níveis de anticorpos. Os resultados demonstraram a capacidade dos adjuvantes testados em potencializar e prolongar a resposta humoral aos antígenos do P. insidiosum. O uso de adjuvantes associado aos atuais imunógenos pode aumentar os índices de cura em eqüinos submetidos à imunoterapia, assim como viabilizar sua utilização como preventivo.

Titulação de vacinas contra o sorotipo 3 do vírus da doença de marek por pcr em tempo real

A Doença de Marek é uma enfermidade linfoproliferativa das aves, causada por um alfaherpesvírus e caracterizada pela infiltração de células em nervos periféricos, gônadas, íris, vísceras, músculos e pele. Desde 1970, vacinas atenuadas têm sido utilizadas como ferramenta principal no controle da doença. Esse trabalho descreve a implantação da Reação em Cadeia da Polimerase em Tempo Real (qPCR) para a titulação de vacinas contra o vírus da doença de Marek do sorotipo 3, herpesvírus dos perus (HVT). A qPCR foi comparada com a técnica tradicional de titulação, baseada no cultivo celular de fibroblastos de embrião de galinha. Foram avaliadas três vacinas vivas (congeladas, cepa FC126) provenientes de distintos fabricantes. A técnica molecular apresentou alta correlação entre os valores de threshold cycle (CT) e respectivas diluições das vacinas (R2 = 0,99), indicando que, dentro desta faixa linear testada (102 a 104 PFU/dose), a qPCR foi capaz de quantificar as vacinas disponíveis no mercado. A reprodutibilidade da titulação em cultivo celular e qPCR foi avaliada pela realização dos testes em três dias distintos a partir de ampolas de um mesmo lote da vacina. Os títulos obtidos por ambos os métodos demonstraram alta reprodutibilidade e coerência com o fornecido pelo fabricante. Caracterizou-se também a proporção de vírus livres e associados às células, onde foi observado que, pelo menos, 90% dos vírus encontravamse na forma associada. Este trabalho indicou que a qPCR é reprodutível, rápida e menos trabalhosa do que a titulação em cultivo celular tradicionalmente utilizada