Diversidade genética de receptores de lactoferrina e transferrina em Moraxella bovis e Moraxella bovoculi

A ceratoconjuntivite infecciosa bovina (CIB) é a doença ocular de maior relevância em bovinos e os principais agentes etiológicos associados são Moraxella bovis e Moraxella bovoculi. Para o controle desta doença a vacinação é imprescindível, entretanto, as vacinas atualmente disponíveis apresentam baixa eficiência. Espécies de Moraxella possuem sistemas capazes de extrair ferro a partir de glicoproteínas compostos por uma proteína integral da membrana externa, as proteínas de ligação à lactoferrina ou transferrina A (LbpA ou TbpA), e uma lipoproteína de superfície, as proteínas de ligação à lactoferrina ou transferrina B (LbpB ou TbpB). Imunização com antígenos derivados desses receptores demonstraram grande capacidade em prevenir infecções, porém, não existem estudos sobre a diversidade genética desses receptores e tampouco foram investigados como potenciais compostos vacinais. Neste contexto, esta tese foi elaborada visando investigar a diversidade genética das proteínas TbpA e TbpB de M. bovis e M. bovoculi (manuscrito 1) e a diversidade genética de LbpA e o desenvolvimento de antígenos híbridos (manuscrito 2). Para o manuscrito 1, 37 sequências de M. bovis e M. bovoculi foram utilizadas, sendo traduzidas para aminoácidos e alinhadas. Posteriormente, árvores filogenéticas foram geradas, e os alinhamentos mapeados nas estruturas preditas das proteínas. As sequências de TbpB foram separadas por espécies e mostraram-se mais variáveis que as de TbpA. Também, foram selecionadas duas cepas representativas de TbpB que provavelmente são capazes de cobrir toda a variabilidade encontrada nessas cepas. No manuscrito 2, análise semelhante foi realizada com trinta e seis sequências de LbpA, além disso, foram construídos cinco antígenos híbridos utilizando quatro combinações diferentes dos loops de LbpA em um esqueleto da lipoproteína de superfície de Vibrio cholerae (VcSLP). LbpA mostrou-se bastante conservada, inclusive em toda sua estrutura. Os antígenos híbridos foram expressos em pequena escala de forma eficiente e apresentaram potencial para serem produzidos em grande escala e analisados como antígenos vacinais. Em conclusão, foi demonstrado em dois estudos diferentes a diversidade de TbpA, TbpB e LbpA e as abordagens que podem ser feitas para produzir antígenos vacinais a partir destas proteínas pensando em abranger toda diversidade genética destes receptores em ambas as espécies.

Infectious bovine keratoconjunctivitis (IBK) is the most important eye disease in cattle, which has a great economic impact due to eye injuries and loss of vision, resulting in pain, reduced milk production, and decreased weight gain. The main etiological agents associated with IBK are Moraxella bovis (M. bovis) and Moraxella bovoculi (M. bovoculi). Vaccination is essential for the disease control; however, currently available vaccines may present limited efficiency. Moraxella spp. have systems capable of extracting iron from the host glycoproteins named lactoferrin and transferrin. Each receptor is composed of an integral outer membrane protein, named lactoferrin or transferrin binding protein A (LbpA or TbpA), and of exposed surface lipoprotein, named lactoferrin or transferrin binding protein B (LbpB or TbpB). These receptors are known to be functionally and genetically related and are known for being essential in the maintenance of pathogens on the mucosal surface leading to disease development. Studies involving immunization with antigens derived from these receptors demonstrate a great capacity to prevent infection, as well as to eliminate colonization of the upper respiratory tract. A great potential of these receptors as vaccine antigens is expected due to their privileged position on the cell surface, and their presumed ubiquity in all isolates of Moraxella spp. However, to date, there have been no studies on the diversity of the pathogens responsible for IBK, or they have been investigated as potential vaccine compounds. In this context, this thesis was designed to investigate the genetic diversity and its distribution in the structure of TbpA and TbpB proteins of M. bovis and M. bovoculi (manuscript 1) and the diversity of LbpA, as well as the development of hybrid antigens (manuscript 2). For manuscript 1, DNA sequences of thirty-seven M. bovis and M. bovoculi strains were translated into amino acids to build phylogenetic trees for each protein. The alignments were then mapped on the predicted structures of the proteins. In the phylogenetic analysis, TbpB sequences were separated by species and more variable than TbpA. Also, two representative strains of TbpB were selected that are likely to be able to cover all the variability found in these strains. In manuscript 2, a similar analysis was performed with thirty-six LbpA sequences, and five hybrid antigens were constructed using four different combinations of LbpA loops in a scaffold of the surface lipoprotein from Vibrio cholerae (VcSLP). LbpA was very conserved also throughout its whole structure. Hybrid antigens were expressed on a small scale efficiently and had the potential to be large scaled for analysis of immunogenicity and cross-reactivity as vaccine antigens. In conclusion, it was demonstrated in two different studies the diversity of TbpA, TbpB, and LbpA and the approaches that can be taken to produce vaccine antigens derived from these proteins intending to cover all the genetic diversity of the species

DETERMINAÇÃO DOS SOROVARES DE HAEMOPHILUS PARASUIS RELACIONADOS COM A DOENÇA DE GLÄSSER NO BRASIL

A Doença de Glässer (DG) é uma doença infecciosa, emergente, e de grande importância para a suinocultura mundial. Seu agente etiológico é o Haemophilus parasuis (H. parasuis), uma bactéria Gram negativa, fastidiosa, fenotipicamente heterogênea e que pode desencadear uma importante patologia sistêmica em suínos, caracterizada por poliserosite fibrinosa, poliartrite e meningite. H. parasuis é classificado em 15 sorovares (SV), no entanto, um número crescente de cepas não-tipificáveis (NS) e relacionadas à surtos de DG tem emergido, demonstrando a variabilidade genética deste microrganismo. O Brasil destaca-se como um dos principais países nessa cadeia de produção, sendo globalmente, o quarto maior em produção e exportação de carne suína. Apesar desta importância, os estudos relacionados à tipificação de cepas clínicas de H. parasuis circulantes no Brasil são escassos e não abordam a distribuição nacional dos sorovares nas principais regiões produtoras de suínos. Em nosso país, a imunoprevenção das infeções produzidas por H. parasuis é realizada através de vacinas comerciais baseadas em bacterinas mono e bivalentes, inativadas com formol e potencializadas com adjuvantes aquosos ou oleosos. Devido aos problemas relacionados com a capacidade protetora dessas vacinas, principalmente em razão da grande variabilidade fenotípica dos diferentes sorovares e da escassa ou ausente proteção cruzada conferida por um único sorovar, o isolamento e tipificação de cepas envolvidas em um surto de DG são determinantes para o desenvolvimento de um programa preventivo baseado em vacinação. Em resposta ao cenário nacional exposto acima, apresentamos neste trabalho: os sorovares de H. parasuis envolvidos em surtos de DG no Brasil; sua distribuição geográfica; o efeito temporal sobre a prevalência de sorovares; e, o impacto destas informações sobre as atuais estratégias preventivas vacinais utilizadas para prevenção da DG. Para alcançar estes objetivos, 460 cepas clínicas de H. parasuis provenientes de dez estados do Brasil, abrangendo as principais regiões produtoras de suínos, foram analisadas. As cepas foram tipificadas através da técnica de PCR multiplex desenvolvida por Howell et al. (2015) e a diferenciação dos sorovares 5 e 12 foi realizada mediante a técnica de hemaglutinação indireta modificada desenvolvida por Lorenson et al. (2017). Nossos resultados demonstram que a nível nacional os sorovares mais prevalente são SV 4 (26.6%), NS (17.6%), SV 1 (13.1%), SV 14 (12.6%) e SV 5 (10.7%). Considerando-se a virulência dos sorovares, de acordo com a classificação proposta por Kielstein e Rapp-Gabrielson (1992), mais da metade do total dos isolados pertencem ao grupo dos sorovares altamente virulentos (51.0%) e 31.4% ao grupo dos sorovares moderadamente virulentos. Observamos que as cepas NS foram isoladas fundamentalmente do sistema respiratório, envolvendo pulmões (64.9%), área nasal (13.0%) e traqueia (10.4%). Por outro lado, os sorovares 5 e 14 foram basicamente isolados de cérebro, coração, articulações e líquidos cavitários. Quando relacionados à virulência, 62.5% dos sorovares altamente virulentos foram isolados a partir de locais sistêmicos e os demais procedentes do sistema respiratório. Em relação à distribuição geográfica, observamos a presença dos sorovares 1, 4, 5, 512, 14, 15 e NS em praticamente todos os estados analisados. Por outro lado, os sorovares 2 e 13 somente foram detectados em SC, MT e MG, além disso o sorovar 12 ficou basicamente restrito ao RS . Os estados com maior número de amostras analisadas foram MG e SC, fato que pode estar relacionado com as altas densidades de suínos produzidos nestas regiões. Também, verificamos que ao longo da linha temporal dos isolamentos ocorreu entre os anos de 2013 a 2016, um aumento no número de isolados clínicos e entre estes, de cepas altamente virulentas. Em síntese, apresentamos neste estudo, uma atualização dos sorovares de H. parasuis associados com a DG no Brasil e, destacamos que as vacinas comerciais disponíveis em nosso pais não incluem 76.3% dos sorovares presentes em nossas granjas produtoras de suínos. Desta maneira, o sucesso da prevenção da DG em nosso país em curto prazo está condicionado ao uso de vacinas autógenas e, em longo prazo, a uma atualização da composição antigênica das atuais vacinas comerciais.

Glässer's disease (GD) is an emerging bacterial disease of great importance to the world's pig farming. Its etiologic agent is Haemophilus parasuis (H. parasuis), a fastidious, phenotypically heterogeneous Gram negative bacterium that can trigger an important systemic pathology in pigs characterized by fibrinous polyserositis, polyarthritis and meningitis. H. parasuis is classified in 15 serovars (SV), however, a growing number of non-typeable (NT) strains and related to outbreaks of GD have emerged, demonstrating the genetic variability of this microorganism. Brazil stands out as one of the main countries in this production chain, being the fourth largest in swine production and exportation. Studies related to typing clinical strains of H. parasuis that are circulating in Brazil are scarce, even with its importance, and there are no studies that demonstrate the national screening of distribution of the serovars in the main producing regions of swine. In our country, the immunoprevention of the H. parasuis infections relays in commercial vaccines based on monovalent and bivalent bacterins inactivated with formalin and potentiated with aqueous or oily adjuvants. Due to the problems related to the protective capacity of these vaccines, mainly due to the high phenotypic variability of the different serovars of this pathogen and the little or absent cross-protection conferred by a single serovar, isolation and characterization of strains involved in a GD outbreak are determinant for the development of more racional vaccine-based preventive program. In response to the national scenario related to H. parasuis and GD, we present here the H. parasuis serovars involved in outbreaks of DG in Brazil, their geographic distribution, the temporal effect on the prevalence of serovars, and the impact of these work in the vaccines actually used. To reach these objectives, 460 clinical isolates of H. parasuis from ten Brazilian states, covering the main swine producing regions, were analyzed. The strains were typed by multiplex PCR technique developed by Howell et al. (2015), and the differentiation of serovars 5 and 12 was performed using the modified indirect hemagglutination technique developed by Lorenson et al. (2017). Our results show that the most prevalent serovars are SV 4 (26.6%), NT (17.6%), SV 1 (13.1%), SV 14 (12.6%) and SV 5 (10.7%). Taking into account the virulence of serovars, according to the classification proposed by Kielstein and Rapp-Gabrielson (1992), more than half of all isolates belong to the highly virulent serovars group (51.0%) and 31.4% to the serovars moderately virulent group. We observed that NT strains were fundamentally isolated from the respiratory system, involving lungs (64.9%), nasal area (13.0%) and trachea (10.4%). On the other hand, serovars 5 and 14 were basically isolated from brain, heart, joints and cavitary fluids. When related to virulence, 62.5% of the highly virulent serovars were isolated from systemic sites and the others from the respiratory system. Regarding the geographic distribution, we observed the presence of serovars 1, 4, 5,5/12, 14, 15 and NS in almost all analyzed states. On the other hand, serovars 2 and 13 were only detected in SC, MT and MG, respectively; in addition, serovar 12 was basically restricted to RS. The states with the highest number of analyzed samples were MG and SC, a fact that may be related to the high densities of pigs produced in these regions. In addition, we observed that the number of field isolates and amongst them of highly virulent strains have increased between 2013 to 2016. In summary, we present an update of H. parasuis serovars associated with GD in Brazil, and we highlight that the commercial vaccines available in our country do not include 76.3% of the serovars present on our pig production farms. Thus, the short-term success of GD prevention in our country is conditioned by the use of autogenous vaccines and, in the long term, an update of the antigenic composition of current commercial vaccines.