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1.
Tese em Português | VETTESES | ID: vtt-220344

Resumo

Este estudo teve como objetivos avaliar: a) um teste de triagem para seleção de doadoras de embrião aptas para coleta transcervical (TC); b) a eficiência das técnicas de coleta de embrião TC ou cirúrgica por laparotomia (LP) e seus efeitos sobre o bem estar animal; c) o efeito do protocolo hormonal de dilatação da cérvix sobre o ambiente uterino e embrião. No primeiro experimento, o resultado do teste de transposição da cérvix no estro foi correlacionado com o resultado do teste imediatamente antes da coleta de embriões, sendo este último, precedido pelo protocolo de dilatação cervical que consistiu em: benzoato de estradiol (100 µg, i.v.) e cloprostenol (0,12 mg, i.m.) 12 h antes da coleta de embriões, acrescido de ocitocina (100 UI, i.v.) 15 min antes da coleta. No segundo experimento, a frequência cardíaca, temperatura retal, concentrações séricas de proteínas totais, albumina, globulina, cortisol e glicose foram mensuradas em animais submetidos à TC ou LP. As taxas de recuperação de fluido e estruturas também foram mensuradas. No terceiro e quarto experimentos, os grupos foram formados por ovelhas tratadas com o protocolo de dilatação da cérvix (descrito acima) ou ovelhas controles (solução salina). No terceiro experimento, a função luteal foi analisada através de ultrassonografia Doppler e mensuração das concentrações de progesterona. Os embriões foram avaliados quanto à morfologia e expressão gênica. Uma análise proteômica do lavado uterino recuperado também foi realizada. No quarto experimento, os embriões recuperados foram fixados para o teste de TUNEL e outra parte foi cultivada in vitro e submetida à qRT-PCR. No primeiro experimento, o teste de transposição apresentou acurácia de 80,0% e índice kappa de 0,52. No segundo experimento, a coleta TC foi mais eficiente que LP (taxas de recuperação de fluido, P = 0.0002; e de estruturas, P = 0.0180). Durante e imediatamente após procedimentos, a temperatura retal foi maior na coleta TC, enquanto que a frequência cardíaca foi maior no pós-operatório tardio da coleta LP (P < 0.05). Houve um pico no decorrer e logo após os procedimentos nas mensurações de glicose (maior na coleta TC, P < 0.05) e cortisol (maior na coleta LP, P < 0.05). A técnica de coleta não afetou as concentrações de proteínas totais, albumina e globulina. Nos dois últimos experimentos, a qualidade morfológica, e índice apoptótico não foram afetados pelo protocolo, mas os corpos lúteos de animais controle tiveram maior perfusão sanguínea em relação a animais tratados (P = 0.002). As concentrações de progesterona foram reduzidas no grupo tratado às 6, 9 e 12 h após a administração do tratamento (P < 0.0001). A expressão dos genes BAX, BCL2, PRDX1, e HSP90 não foi afetada pelo protocolo. Contudo, os embriões do grupo tratado tiveram menos transcritos de NANOG e OCT4 que embriões do grupo controle (P = 0.008; P = 0.006, respectivamente). Após o cultivo, não houve diferenças entre os grupos em nenhum gene. No lavado uterino, o grupo tratado obteve 436 proteínas exclusivas, destas 16 foram significativamente mais expressas que no grupo controle (P < 0,05). No grupo controle, 126 proteínas exclusivas e cinco proteínas diferenciais foram encontradas (P < 0.05). Em conclusão, o teste de transposição cervical é uma opção de triagem para doadoras de embrião pela técnica TC, que é mais eficiente e, possivelmente, menos estressante que a técnica LP. Contudo, o protocolo hormonal para dilatação cervical promove luteólise e uma alteração temporária da expressão gênica dos embriões, além de um perfil proteico do fluido uterino modificado.


This study aimed to evaluate: a) a screening test to select suitable embryo donors for transcervical collection (TC); b) the efficiency of embryo collection techniques TC or surgical by laparotomy (LP), and their effects on animal welfare; c) the effect of the hormonal protocol for dilation of the cervix on the uterine environment and embryo. In the first experiment, the result of the cervix transposition test at estrus was correlated with the test result immediately before embryo collection, the latter was preceded by the cervical dilation protocol which consisted of: estradiol benzoate (100 µg, iv) and cloprostenol (0.12 mg, im) 12 h before embryo collection, plus oxytocin (100 IU, iv) 15 min before collection. In the second experiment, heart rate, rectal temperature, serum concentrations of total proteins, albumin, globulin, cortisol and glucose were measured in animals submitted to TC or LP. The rates of fluid recovery and structures were also measured. In the third and fourth experiments, the groups were formed by ewes treated with the cervix dilation protocol (described above) or ewes control (saline). In the third experiment, luteal function was analyzed using Doppler ultrasound and measurement of progesterone concentrations. The embryos were evaluated for morphology and gene expression. A proteomic analysis of the recovered uterine lavage was also performed. In the fourth experiment, the recovered embryos were fixed for the TUNEL test and another part was cultured in vitro and submitted to qRT-PCR. In the first experiment, the transposition test showed an accuracy of 80.0% and a kappa index of 0.52. In the second experiment, TC collection was more efficient than LP (fluid recovery rates, P = 0.0002; and structures, P = 0.0180). During and immediately after procedures, the rectal temperature was greater in the TC collection, while the heart rate was greater in the late postoperative period of the LP collection (P < 0.05). There was a peak during and after the procedures in the measurements of glucose (greater in the TC collection, P < 0.05) and cortisol (greater in the LP collection, P < 0.05). The collection technique did not affect the concentrations of total proteins, albumin and globulin. In the last two experiments, the morphological quality and apoptotic index were not affected by the protocol, but the corpora lutea of control animals had greater blood perfusion compared to treated animals (P = 0.002). Progesterone concentrations were reduced in the treated group at 6, 9 and 12 h after treatment administration (P < 0.0001). The expression of the BAX, BCL2, PRDX1, and HSP90 genes was not affected by the protocol. However, embryos in the treated group had fewer NANOG and OCT4 transcripts than embryos in the control group (P = 0.008; P = 0.006, respectively). After culture, there were no differences between groups in any gene. In the uterine lavage, the treated group obtained 436 exclusive proteins, which 16 were significantly more expressed than in the control group (P < 0.05). In control group, 126 exclusive proteins and five differential proteins were found (P < 0.05). In conclusion, the cervical transposition test is a screening option for embryo donors by TC technique, which is more efficient and, possibly less stressful than the LP technique. However, the hormonal protocol for cervical dilation promotes luteolysis and a temporary alteration in the gene expression of the embryos, as well as a modified uterine fluid protein profile.

2.
Tese em Português | VETTESES | ID: vtt-204663

Resumo

A maturação oocitária é uma importante etapa da produção in vitro de embriões, sendo dependente da qualidade do oócito, a qual determina sua competência ao desenvolvimento. A estimulação hormonal ovariana com gonadotrofinas pode influenciar a expressão gênica nas células cumulus (CCs) de complexos cumulus-oócito (CCOs) e, consequentemente, a qualidade oocitária. Adicionalmente, a maturação in vitro (MIV) dos CCOs envolve a síntese de ácido hialurônico para que haja a expansão do cumulus. Nesse evento, também ocorre a regulação da expressão de conexinas, as quais compõem as junções gap existentes entre o cumulus e o oócito. Assim, no presente trabalho, em paralelo à classificação morfológica (GI/II ou GIII) e avaliação da taxa de MIV, investigou-se a expressão dos genes que codificam a enzima ácido hialurônico sintase-2 (HAS2), os receptores gonadotróficos do hormônio folículo estimulante (FSHR) e do luteinizante (LHR) e a conexina 43 em CCs oriundas de CCOs caprinos obtidos após estimulação hormonal ovariana com múltiplas doses de FSH (MD) ou única dose de FSH/eCG (Oneshot - OS). Adicionalmente, CCOs bovinos oriundos de abatedouro foram utilizados como grupo controle. O tratamento MD produziu maior número de folículos grandes (>4 mm), CCOs com melhor aspecto morfológico (GI/II) e melhor taxa de MIV que OS. O tratamento OS produziu CCOs com CCs que apresentaram maior nível de transcritos para todos os genes analisados. Esta maior expressão gênica também foi observada em CCs de CCOs com aspecto morfológico inferior (GIII). Por outro lado, os níveis de RNAm tornaram-se mais semelhantes entre os grupos após a MIV, principalmente com o decréscimo dos transcritos para FSHR e LHR. Alguns eventos que ocorreram durante a MIV bovina, como a expansão das células, o aumento de HAS2 e decréscimo de Cx43, foram menos evidentes ou não observados na MIV caprina. Em conclusão, o tratamento OS produziu CCOs com maior nível de transcritos para HAS2, receptores gonadotróficos e conexina 43, comparado a MD. Contudo, esse maior nível de transcritos não conferiu maior competência meiótica aos oócitos e pode estar relacionado a uma regulação deficiente da expressão gênica por oócitos de menor qualidade. Finalmente, a expansão, o aumento da expressão de HAS2 e o decréscimo da síntese de Cx43, parecem ser eventos mais evidentes nas CCs de CCOs durante a MIV bovina que na caprina. Estudos adicionais são ainda necessários para investigar a importância de outras isoformas de HAS ou de conexinas em CCOs caprinos.


The oocyte maturation is an important step of in vitro embryo production, being dependent on oocyte quality, which determines their competence development. Ovarian stimulation with gonadotropins can influence gene expression in the cumulus cells (CCs) of cumulus-oocyte complexes (COCs) and, consequently, the oocyte quality. Additionally, in vitro maturation (IVM) of COCs involves hyaluronic acid synthesis for cumulus expansion. In this event, there is also the regulation of connexin expression, which make up the gap junctions existing between the cumulus and oocyte. In the present work, in parallel with the morphological classification (GI/II or GIII) and evaluation of IVM rate, we investigated the expression of genes encoding the enzyme hyaluronic acid synthase-2 (HAS2), the gonadotropic receptors of follicle stimulating hormone (FSHR) and luteinizing hormone (LHR) and connexin 43 in CCs derived from COCs goats obtained after ovarian hormonal stimulation with multiple doses of FSH (MD) or a single dose of FSH/eCG (OS). The MD treatment produced higher number of large follicles, COCs with great morphological aspects and IVM rate than OS. Additionally, bovine COCs originating from slaughterhouse were used as control group. The MD treatment produced higher number of large follicles (>4 mm), COCs with great morphological aspects and IVM rate than OS. The OS treatment produced COCs with more HAS2, FSHR, LHR and Cx43 transcripts. This gene expression pattern was also observed in CCs of COCs showing poor morphological characteristics. On the other hand, the mRNA levels becomes more similar between groups after IVM, mainly decreasing FSHR and LHR transcripts. Some events that occurred during the bovine IVM, such as the expansion of the cells, the increase of HAS2 and decrease of Cx43 were less apparent or not observed in goat IVM. In conclusion, the OS treatment produced COCs with a higher level of transcripts for HAS2, gonadotropic receptors and connexin 43, compared to MD. However, increasing in HAS2, FSHR, LHR and Cx43 expressions in goat COCs do not confer more meiotic competence to oocytes. Instead, it may be resulted from a poor regulation of gene expression in CCs by lower quality oocytes. Finally, cumulus expansion together with HAS2 upregulation and Cx43 downregulation seems to be more important IVM events for bovine than for goat COCs. Further studies are needed to investigate the importance of other HAS isoforms or connexins in goat COCs.

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