Resumo
The temperature-sensitive hemagglutinin (Tsh) belongs to a family of high-molecular-weight serine protease autotransporters of Enterobacteriaceae (SPATEs), which can cleave different substrates. We isolated and characterised the tsh gene from an avian pathogenic Escherichia coli (APEC) strain, APEC13 serotype O2:H9, which was cloned in pET101. The 4.2 kb region of cloned DNA coded one protein of approximately 140 kDa (r-Tsh). The recombinant plasmid pET101-tsh conferred to E. coli BL21 strain (tsh) the hemagglutination-positive phenotype against chicken erythrocytes. The r-Tsh was purified by Ni-NTA column and used to produce antibody anti-Tsh. A 1.6 kb fragment of the tsh sequence was also amplified and cloned in pCR4, and a partial sequence showed high homology with other sequence analysed. The anti-Tsh reacted with the protein r-Tsh and native Tsh of APEC13, as demonstrated by Western blot, showing that r-Tsh has conserved epitopes and that its antigenicity was preserved. The anti-Tsh also inhibited the hemagglutinating activity of strains APEC13 and BL21/pET101-tsh.
A hemaglutinina temperatura sensível (Tsh) pertence à família das serino-proteases autotransporte de Enterobacteriacea (SPATE), as quais são capazes de clivar diferentes substratos. Nós isolamos e caracterizamos o gene de Escherichia coli patogênica aviária (APEC) amostra APEC 13, sorotipo O2:H9,clonado em pET101. A região de 4.2 kb do DNA clonado codifificou uma proteína de aproximadamente 140 kDa (r-Tsh). O plasmídio recombinante pET101-tsh conferiu um fenótipo de hemaglutinação positivo para a linhagem BL21 (tsh-) para eritrócitos de galinha. A proteína r-Tsh foi purificada em coluna de níquel e utilizada na produção de anticorpos anti-Tsh. Um fragmento de 1.6 kb foi amplificado e subclonado em pCR4, e a seqüência parcial mostrou alta homologia com outras seqüências analisadas. O anti-Tsh reagiu com as proteínas r-Tsh e Tsh nativa da amostra APEC13, como demonstrado pela técnica de Western blot, mostrando que a r-Tsh tem epitopos conservados e que sua antigenicidade foi preservada. O anti-Tsh também inibiu a atividade hemaglutinante das amostras APEC13 e BL21/pET 101-tsh.
Resumo
In this work, the prevalence of enteropathogenic Escherichia coli (EPEC) in children in Londrina-PR, Brazil, was evaluated by means of digoxigenin-labelled DNA probes which identify the plasmid responsible for EPEC adherence factor (EAF), and virulence genes for EPEC as bundle-forming pilus (bfp) and E. coli attaching-effacing factor (eae). In addition, the isolated strains were serotyped and tested for adherence to HEp-2 cells. From 102 children with diarrhoea, 19 strains hybridized with at least one probe, and eleven of them were identified as typical EPEC because they hybridized with the three probes used, showed a localized adherence (LA) pattern, and presented no genes for enterotoxins (ST and LT) or invasion as detected by PCR. Six of the typical EPEC strains belonged to the classical serotype O119:H6 (43%); in four strains O antigens could not be determined using antisera against O1 to O173, they were all ONT:H7 (29%); one strain belonged to O111:H6. Three strains were classified as atypical EPEC: O26H-, O111:H9 and O119:HNT. Strains O26H- and O111:H9 hybridized with the eae probe only and showed localized adherence like (LAL) pattern; strain O119:HNT hybridized with the bfp and eae probes, and showed a localized adherence/diffuse adherence (LA/DA) pattern after 6 h. A DA pattern was observed in two strains isolated from children with diarrhoea (ONT:H11 and O142:H34), which hybridized with the eae probe. From 46 controls, five strains hybridized with one or two probes, but none hybridized with all probes or presented the LA pattern. Three strains with the DA pattern hybridized with the eae probe. No EPEC strain belonging to classical EPEC serotypes was isolated from faeces of control children.
A prevalência de Escherichia coli enteropatogênica (EPEC) em crianças em Londrina-PR, Brazil, foi avaliada através de sondas de DNA marcadas com digoxigenina, as quais identificam o plasmidio EAF (EPEC adherence factor) e os genes de virulência para EPEC, bfp (bundle-forming pilus) e eae (E. coli attaching and effacing). As amostras de E. coli foram também sorotipadas e testadas para a aderência às células HEp-2. Das 102 crianças com diarréia, 19 colonias de E. coli hibridizaram com pelo menos uma sonda, e destas, 11 foram identificadas como EPEC típica pois hibridizaram com as 3 sondas testadas. Todas as EPEC típicas apresentaram o padrão de aderência localizada e não apresentaram os genes para enterotoxinas (ST e LT) e invasão por PCR. Seis EPEC típica (43%) pertenceram ao sorotipo clássico O119:H6, uma ao sorotipo O111:H6 e em quatro amostras (29%) o antígeno O não foi determinado com os soros contra O1-O173 (ONT:H7). Três amostras foram classificadas como EPEC atípicas: O26H-, O111:H9 e O119:HNT. E. coli O26H- e O111:H9 hibridizaram somente com eae e mostraram padrão de aderência localizada "like" (LAL); O119:HNT hibridizou com as sondas bfp e eae, e mostrou padrão de aderência localizada/difusa (LA/DA) após 6 h. O padrão DA foi observado em duas amostras (ONT:H11 e O142:H34) isoladas de crianças com diarréia, as quais hibridizaram com eae. Dos 46 controles, cinco colônias hibridizaram com pelo menos uma sonda, mas nenhuma hibridizou com as 3 sondas testadas ou apresentou LA. Três amostras com padrão DA hibridizaram com sonda eae. Nenhuma EPEC com sorotipo clássico foi encontrada nas fezes de crianças controle.