The use of reduced glutathione (GSH) as antioxidant for cryopreserved sperm in dogs / O uso da glutationa reduzida (GSH) como antioxidante na criopreservação seminal em cães

The aim of this study was to evaluate the effect of supplementation with different concentrations of reduced glutathione GSH (0; 5; 7.5; 10mM) in the extender for cryopreservation in dogs with evaluations performed after glycerolization (chilled) and thawing (thawed). For this purpose, we used 8 dogs and two semen collections were performed in a weekly interval, totaling 16 semen samples. The sperm were analyzed by automatic sperm motility (CASA) and flow cytometry analysis of mitochondrial potential (JC1 dye) and membrane/acrosome integrity (FITC-PI dyes). We evaluated subjectively the membrane and acrosome integrity, mitochondrial activity and DNA integrity. Seminal plasma was evaluated for lipid peroxidation (TBARS concentration). Chilled and thawed samples supplemented with 7.5 and 10mM of GSH had lower percentage of sperm with high (DAB - Class I) and medium (DAB - Class II) mitochondrial activity. And 10mM of GSH had higher percentage of low mitochondrial activity (DAB - Class III). Moreover, thawed samples of 10mM of GSH had high DNA fragmentation rates. Probably by a reductive stress effect on mitochondria which lead to an increase in reactive oxygen species, and a mitochondrial malfunction.(AU)

O objetivo deste estudo foi avaliar o efeito da suplementação com diferentes concentrações de glutationa reduzida (GSH - 0; 5; 7,5; 10mM) para criopreservação em cães com avaliações realizadas após glicerolização (refrigeração) e descongelação. Para tal, foram utilizados oito cães e foram realizadas duas coletas de sêmen em intervalo semanal, totalizando 16 amostras de sêmen. Foram avaliadas a motilidade espermática computadorizada (CASA) e a análise de citometria de fluxo do potencial mitocondrial (sonda JC-1) e integridade da membrana/acrossomal (sonda FITC-PI). Subjetivamente foi avaliada a integridade da membrana plasmática e do acrossomal, atividade mitocondrial e integridade do DNA. O plasma seminal foi avaliado quanto à peroxidação lipídica (concentração de TBARS). As amostras refrigeradas e descongeladas suplementadas com 7,5 e 10mM de GSH apresentaram menor porcentagem de espermatozoides com alta atividade mitocondrial (DAB - Classe I) e média (DAB - Classe II). Na concentração de 10mM de GSH, apresentaram maior porcentagem de baixa atividade mitocondrial (DAB - Classe III). Além disso, amostras descongeladas de 10mM de GSH apresentaram taxas de fragmentação de DNA elevadas, provavelmente por efeito de estresse redutivo sobre as mitocôndrias que elevam as espécies reativas de oxigênio e disfunção mitocondrial.(AU)

The use of reduced glutathione (GSH) as antioxidant for cryopreserved sperm in dogs / O uso da glutationa reduzida (GSH) como antioxidante na criopreservação seminal em cães

The aim of this study was to evaluate the effect of supplementation with different concentrations of reduced glutathione GSH (0; 5; 7.5; 10mM) in the extender for cryopreservation in dogs with evaluations performed after glycerolization (chilled) and thawing (thawed). For this purpose, we used 8 dogs and two semen collections were performed in a weekly interval, totaling 16 semen samples. The sperm were analyzed by automatic sperm motility (CASA) and flow cytometry analysis of mitochondrial potential (JC1 dye) and membrane/acrosome integrity (FITC-PI dyes). We evaluated subjectively the membrane and acrosome integrity, mitochondrial activity and DNA integrity. Seminal plasma was evaluated for lipid peroxidation (TBARS concentration). Chilled and thawed samples supplemented with 7.5 and 10mM of GSH had lower percentage of sperm with high (DAB - Class I) and medium (DAB - Class II) mitochondrial activity. And 10mM of GSH had higher percentage of low mitochondrial activity (DAB - Class III). Moreover, thawed samples of 10mM of GSH had high DNA fragmentation rates. Probably by a reductive stress effect on mitochondria which lead to an increase in reactive oxygen species, and a mitochondrial malfunction.(AU)

O objetivo deste estudo foi avaliar o efeito da suplementação com diferentes concentrações de glutationa reduzida (GSH - 0; 5; 7,5; 10mM) para criopreservação em cães com avaliações realizadas após glicerolização (refrigeração) e descongelação. Para tal, foram utilizados oito cães e foram realizadas duas coletas de sêmen em intervalo semanal, totalizando 16 amostras de sêmen. Foram avaliadas a motilidade espermática computadorizada (CASA) e a análise de citometria de fluxo do potencial mitocondrial (sonda JC-1) e integridade da membrana/acrossomal (sonda FITC-PI). Subjetivamente foi avaliada a integridade da membrana plasmática e do acrossomal, atividade mitocondrial e integridade do DNA. O plasma seminal foi avaliado quanto à peroxidação lipídica (concentração de TBARS). As amostras refrigeradas e descongeladas suplementadas com 7,5 e 10mM de GSH apresentaram menor porcentagem de espermatozoides com alta atividade mitocondrial (DAB - Classe I) e média (DAB - Classe II). Na concentração de 10mM de GSH, apresentaram maior porcentagem de baixa atividade mitocondrial (DAB - Classe III). Além disso, amostras descongeladas de 10mM de GSH apresentaram taxas de fragmentação de DNA elevadas, provavelmente por efeito de estresse redutivo sobre as mitocôndrias que elevam as espécies reativas de oxigênio e disfunção mitocondrial.(AU)

The influence of canine brucellosis on morphofunctional features of epididymal spermatozoa: case report / Influência da brucelose canina nos aspectos morfofuncionais de espermatozoides epididimários: relato de caso

The present work reports a clinical case of a mongrel dog, with serological diagnosis of brucellosis, from which epididymal sperm analysis was performed. Sperm samples were collected from different segments of the epididymis (tail, corpus, and caput). Sperm samples were evaluated for computer-assisted motility analysis (CASA), spermatic morphology, mitochondrial activity and sperm plasmatic membrane and acrosomal integrity. Changes in sperm movement patterns were found (progressive motility, percentage of rapid sperm, percentage of rapid velocity, average pathway, curvilinear velocity, velocity straight line, amplitude of lateral head displacement, straightness and linearity), increase of total morphological defects (51%) and absence of sperm mitochondrial activity (20%) were verified, especially for cauda epididymides. We highlight that such changes can contribute to clinical diagnosis of Brucellosis in dogs and to the use of epididymal sperm in reproductive biotechnologies.(AU)

Relata-se o caso de um cão mestiço, com diagnóstico sorológico para brucelose canina, a partir do qual foram realizadas análises do sêmen epididimário. As amostras espermáticas foram coletadas dos diferentes segmentos epididimários (cabeça, corpo e cauda). Foram realizadas as avaliações de motilidade computadorizada do sêmen (CASA), morfologia espermática, atividade mitocondrial, integridade das membranas plasmática e acrossomal. Houve alteração no padrão de movimentação espermática (motilidade progressiva, espermatozoides rápidos, velocidade média da trajetória, velocidade curvilínea, velocidade linear progressiva, amplitude de deslocamento lateral da cabeça, retilinearidade e linearidade), aumento do total de defeitos morfológicos (51%) e da ausência de atividade mitocondrial espermática (20%) dos espermatozoides, especialmente da cauda do epidídimo. Ressalta-se que tais achados podem contribuir para o diagnóstico clínico da brucelose canina e para a utilização do sêmen epididimário em biotecnologias da reprodução.(AU)

The influence of canine brucellosis on morphofunctional features of epididymal spermatozoa: case report / Influência da brucelose canina nos aspectos morfofuncionais de espermatozoides epididimários: relato de caso

The present work reports a clinical case of a mongrel dog, with serological diagnosis of brucellosis, from which epididymal sperm analysis was performed. Sperm samples were collected from different segments of the epididymis (tail, corpus, and caput). Sperm samples were evaluated for computer-assisted motility analysis (CASA), spermatic morphology, mitochondrial activity and sperm plasmatic membrane and acrosomal integrity. Changes in sperm movement patterns were found (progressive motility, percentage of rapid sperm, percentage of rapid velocity, average pathway, curvilinear velocity, velocity straight line, amplitude of lateral head displacement, straightness and linearity), increase of total morphological defects (51%) and absence of sperm mitochondrial activity (20%) were verified, especially for cauda epididymides. We highlight that such changes can contribute to clinical diagnosis of Brucellosis in dogs and to the use of epididymal sperm in reproductive biotechnologies.(AU)

Relata-se o caso de um cão mestiço, com diagnóstico sorológico para brucelose canina, a partir do qual foram realizadas análises do sêmen epididimário. As amostras espermáticas foram coletadas dos diferentes segmentos epididimários (cabeça, corpo e cauda). Foram realizadas as avaliações de motilidade computadorizada do sêmen (CASA), morfologia espermática, atividade mitocondrial, integridade das membranas plasmática e acrossomal. Houve alteração no padrão de movimentação espermática (motilidade progressiva, espermatozoides rápidos, velocidade média da trajetória, velocidade curvilínea, velocidade linear progressiva, amplitude de deslocamento lateral da cabeça, retilinearidade e linearidade), aumento do total de defeitos morfológicos (51%) e da ausência de atividade mitocondrial espermática (20%) dos espermatozoides, especialmente da cauda do epidídimo. Ressalta-se que tais achados podem contribuir para o diagnóstico clínico da brucelose canina e para a utilização do sêmen epididimário em biotecnologias da reprodução.(AU)

Utilização de pentoxifilina e antioxidantes na criopreservação do sêmen bovino: qualidade seminal e estresse oxidativo / Utilization of pentoxifylline and antioxidants in cryopreservation of bovine semen: semen quality and oxidative stress

O presente estudo avaliou a adição da pentoxifilina, tocoferol, ascorbato e suas combinações sobre a proteção da célula espermática bovina contra os efeitos deletérios da criopreservação. Foram utilizados 24 touros Nelores (Bos taurus indicus), criados em sistema semi-intensivo. Foi coletado um ejaculado de cada reprodutor, diluídos em TRIS-citratogema-glicerol e divididos em seis partes. Cada parte foi suplementada da seguinte maneira: sem aditivos (controle), tocoferol (10 mmol/mL), tocoferol (10 mmol/mL) + pentoxifilina (1mg/mL), ascorbato (0,45mg/mL), ascorbato (0,45mg/mL) + pentoxifilina (1mg/mL) ou pentoxifilina (1mg/mL). Após o descongelamento, as amostras foram avaliadas quanto à motilidade e características do movimento, integridade da membrana plasmática e de acrossomo e atividade mitocondrial. Os níveis de peroxidação lipídica espontânea e induzida foram avaliados pela produção de substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS). A suplementação com pentoxifilina, tocoferol, ascorbato e suas combinações, não alterou (P>0,05) a atividade mitocondrial, integridade acrossomal, e a concentração de TBARS espontâneo e induzido. A adição de tocoferol + pentoxifilina reduziu a motilidade progressiva quando comparado ao ascorbato e também a integridade da membrana espermática quando comparado ao controle e ao ascorbato (P˂0,05). Já a adição de ascorbato + pentoxifilina foi deletéria sobre linearidade em comparação ao tratamento ascorbato (P˂0,05). A adição de ascorbato, tocoferol e pentoxifilina individualmente ou em combinação, não foi eficiente em diminuir os danos causados pela criopreservação e estresse oxidativo em amostras pós descongelamento de sêmen bovino.

The present study evaluated the addition of pentoxifylline, tocopherol and ascorbate and their combinations on the protection of bovine spermatic cells against the deleterious effects of cryopreservation. A total of 24 Nelore bulls (Bos Taurus indicus) were included in this study, raised in a semi-intensive system. One ejaculation was collected from each bull and diluted in tris-citrate-yolk-glycerol, divided into six portions, and then supplemented with: no additives (control); tocopherol (10 mmol/ml), tocopherol (10 mmol/ml) + pentxoifylline (1 mg/ml), ascorbate (0.45 mg/ml), ascorbate (0.45 mg/ml) + pentoxifylline (1 mg/ml) and pentxoifylline (1 mg/ml). After thawing, the samples were evaluated for motility and characteristics of movement, acrosomal and plasma membrane integrity, and mitochondrial activity. Spontaneous and induced lipid peroxidation levels were evaluated by the production of thiobarbituric acid reactive substances (TBARS). Supplementation with pentoxifylline, tocopherol and ascorbate and their combinations, did not alter mitochondrial activity, acrosomal integrity, or the spontaneous and induced TBARS concentration (P>0.05). The ascorbate, tocopherol and pentoxifylline additions, both individually and in combinations, were inefficient in decreasing the damage caused by cryopreservation and oxidative stress in post-thawed bovine semen samples.

Utilização de pentoxifilina e antioxidantes na criopreservação do sêmen bovino: qualidade seminal e estresse oxidativo / Utilization of pentoxifylline and antioxidants in cryopreservation of bovine semen: semen quality and oxidative stress

O presente estudo avaliou a adição da pentoxifilina, tocoferol, ascorbato e suas combinações sobre a proteção da célula espermática bovina contra os efeitos deletérios da criopreservação. Foram utilizados 24 touros Nelores (Bos taurus indicus), criados em sistema semi-intensivo. Foi coletado um ejaculado de cada reprodutor, diluídos em TRIS-citratogema-glicerol e divididos em seis partes. Cada parte foi suplementada da seguinte maneira: sem aditivos (controle), tocoferol (10 mmol/mL), tocoferol (10 mmol/mL) + pentoxifilina (1mg/mL), ascorbato (0,45mg/mL), ascorbato (0,45mg/mL) + pentoxifilina (1mg/mL) ou pentoxifilina (1mg/mL). Após o descongelamento, as amostras foram avaliadas quanto à motilidade e características do movimento, integridade da membrana plasmática e de acrossomo e atividade mitocondrial. Os níveis de peroxidação lipídica espontânea e induzida foram avaliados pela produção de substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS). A suplementação com pentoxifilina, tocoferol, ascorbato e suas combinações, não alterou (P>0,05) a atividade mitocondrial, integridade acrossomal, e a concentração de TBARS espontâneo e induzido. A adição de tocoferol + pentoxifilina reduziu a motilidade progressiva quando comparado ao ascorbato e também a integridade da membrana espermática quando comparado ao controle e ao ascorbato (P˂0,05). Já a adição de ascorbato + pentoxifilina foi deletéria sobre linearidade em comparação ao tratamento ascorbato (P˂0,05). A adição de ascorbato, tocoferol e pentoxifilina individualmente ou em combinação, não foi eficiente em diminuir os danos causados pela criopreservação e estresse oxidativo em amostras pós descongelamento de sêmen bovino.(AU)

The present study evaluated the addition of pentoxifylline, tocopherol and ascorbate and their combinations on the protection of bovine spermatic cells against the deleterious effects of cryopreservation. A total of 24 Nelore bulls (Bos Taurus indicus) were included in this study, raised in a semi-intensive system. One ejaculation was collected from each bull and diluted in tris-citrate-yolk-glycerol, divided into six portions, and then supplemented with: no additives (control); tocopherol (10 mmol/ml), tocopherol (10 mmol/ml) + pentxoifylline (1 mg/ml), ascorbate (0.45 mg/ml), ascorbate (0.45 mg/ml) + pentoxifylline (1 mg/ml) and pentxoifylline (1 mg/ml). After thawing, the samples were evaluated for motility and characteristics of movement, acrosomal and plasma membrane integrity, and mitochondrial activity. Spontaneous and induced lipid peroxidation levels were evaluated by the production of thiobarbituric acid reactive substances (TBARS). Supplementation with pentoxifylline, tocopherol and ascorbate and their combinations, did not alter mitochondrial activity, acrosomal integrity, or the spontaneous and induced TBARS concentration (P>0.05). The ascorbate, tocopherol and pentoxifylline additions, both individually and in combinations, were inefficient in decreasing the damage caused by cryopreservation and oxidative stress in post-thawed bovine semen samples.(AU)

Ferramentas para avaliação da funcionalidade da mitocôndria espermática / Tools for evaluating the functionality of sperm mitochondria

A mitocôndria é a principal fonte de energia para a motilidade e a homeostase espermática. Durante afosforilação oxidativa são produzidos metabólitos, denominados espécies reativas de oxigênio (EROs), as quaisdesempenham papel fundamental nos processos fisiológicos. No entanto, disfunções mitocondriais podem causardesequilíbrio entre a produção de EROs e os mecanismos antioxidantes, provocando o estresse oxidativo, letalpara a célula espermática. Assim, como essa organela está envolvida tanto nos processos fisiológicos quanto nospatológicos dos espermatozoides, fica clara a importância de se avaliar sua funcionalidade. Portanto, o objetivodesta revisão é descrever as possíveis técnicas de avaliação da funcionalidade das mitocôndrias espermáticas pormeio da atividade e do potencial da membrana mitocondrial, da mensuração dos níveis de ATP e ADP e damensuração dos níveis de cálcio.(AU)

Mitochondria are the major source of energy for sperm motility and to the homeostasis. During theoxidative phosphorylation metabolites called Reactive Oxygen Species (ROS), are produced and play a key rolefor the physiological processes. However, mitochondrial dysfunctions can cause an imbalance between ROSproduction and antioxidant mechanisms cause oxidative stress, lethal for spermatozoa. Thus, as this organelle isinvolved both in physiological or pathological processes of sperm, it is clear the importance of evaluating itsfunctionality. Therefore, the aim of this review is to describe the possible techniques for assessing functionalityof sperm mitochondria and these assessments of activity and mitochondrial membrane potential, measuring thelevels of ATP and ADP and measurement the levels of calcium.(AU)

Ferramentas para avaliação da funcionalidade da mitocôndria espermática / Tools for evaluating the functionality of sperm mitochondria

A mitocôndria é a principal fonte de energia para a motilidade e a homeostase espermática. Durante afosforilação oxidativa são produzidos metabólitos, denominados espécies reativas de oxigênio (EROs), as quaisdesempenham papel fundamental nos processos fisiológicos. No entanto, disfunções mitocondriais podem causardesequilíbrio entre a produção de EROs e os mecanismos antioxidantes, provocando o estresse oxidativo, letalpara a célula espermática. Assim, como essa organela está envolvida tanto nos processos fisiológicos quanto nospatológicos dos espermatozoides, fica clara a importância de se avaliar sua funcionalidade. Portanto, o objetivodesta revisão é descrever as possíveis técnicas de avaliação da funcionalidade das mitocôndrias espermáticas pormeio da atividade e do potencial da membrana mitocondrial, da mensuração dos níveis de ATP e ADP e damensuração dos níveis de cálcio.

Mitochondria are the major source of energy for sperm motility and to the homeostasis. During theoxidative phosphorylation metabolites called Reactive Oxygen Species (ROS), are produced and play a key rolefor the physiological processes. However, mitochondrial dysfunctions can cause an imbalance between ROSproduction and antioxidant mechanisms cause oxidative stress, lethal for spermatozoa. Thus, as this organelle isinvolved both in physiological or pathological processes of sperm, it is clear the importance of evaluating itsfunctionality. Therefore, the aim of this review is to describe the possible techniques for assessing functionalityof sperm mitochondria and these assessments of activity and mitochondrial membrane potential, measuring thelevels of ATP and ADP and measurement the levels of calcium.