Resumo
O objetivo geral dessa tese foi avaliar as associações da sazonalidade e do clima tropical úmido com as características seminais de búfalos criados em regime extensivo, com suplementação no período de seca. Foram utilizados ao longo dos experimentos de seis a nove touros búfalos da raça Murrah, submetidos a regime semanal de coleta de sêmen com auxílio de vagina artificial aquecida, durante os períodos de junho de 2014 a maio de 2016. As amostras de sêmen foram selecionadas quanto a sua qualidade espermática imediatamente após a coleta e então submetidas ao processo de congelamento em máquina computadorizada, diluídas em diluidor comercial. Após o descongelamento as amostras foram avaliadas quanto a cinética espermática (por metodologia CASA), integridade funcional de membranas (teste hiposmótico), integridade estrutural de membrana plasmática e integridade da cromatina espermática (citometria de fluxo). As características seminais após o descongelamento foram comparadas de acordo com a época da realização da coleta do sêmen. Amostras de plasma seminal foram obtidas por centrifugações sucessivas das amostras de sêmen e posteriormente submetidas a dosagens de proteína total do plasma seminal, separação de bandas proteicas (SDS-PAGE) e mapa da distribuição de spots de proteínas (2D SDS-PAGE). Os spots de proteínas predominantes, bem como àqueles diferencialmente expressos entre os períodos de coleta de sêmen, foram identificados utilizando espectrômetro de massas (ESI-Q-ToF). Nesse estudo foi possível perceber a associação das variáveis climáticas sobre a resistência espermática ao congelamento, e sobre o padrão de distribuição de proteínas no plasma seminal. Em situações de pico do índice de pluviosidade (atípico), obtiveram-se maiores valores dos parâmetros cinéticos (exceto LIN) e de integridade estrutural e funcional da membrana plasmática. Na ausência de valores extremos de chuva, foram obtidos maiores valores de cinética espermática (exceto MT, LIN e BCF) no período de menor estresse térmico, estimado pelo índice de temperatura e umidade (ITU). Quanto a quantificação de proteínas total do plasma seminal, não houve diferença entre os períodos estudados, entretanto houve mudança no padrão de expressão de certas proteínas. As proteínas carboxipeptidase Q e albumina foram mais intensamente expressas em período de menor ITU, já as proteínas fetuina B, receptor de imunoglobulina polimérica, ligadora de acrosina, macroglobulina alfa2 e superóxido dismutase extracelular foram mais expressas no período de maior ITU (maior estresse térmico estimado). O proteoma principal do plasma seminal de búfalos foi pela primeira vez descrito, sendo as proteínas com maior intensidade de expressão as isoformas da família das secretoglobinas, espermadesinas Z13, clusterinas, família das BSP, albumina e zinco-alfa2-glicoproteínas.
The general objective of this thesis was to evaluate the associations of seasonality and tropical humid climate with the seminal characteristics of buffaloes raised in an extensive regime, with supplementation in the dry season. Six to nine buffalo bulls of the Murrah breed were used throughout the experiments, under a weekly regimen of semen collection with the aid of a heated artificial vagina, during the periods from June 2014 to May 2016. The semen samples were selected on their spermatic quality immediately after the collection and then submitted to the process of computerized freezing, diluted in commercial diluent. After thawing, the samples were evaluated for spermatic kinetics (CASA method), membrane functional integrity (hyposmotic test), structural integrity of plasma membrane and integrity of sperm chromatin (flow cytometry). Sperm characteristics after thawing were compared according to the time of semen collection. Seminal plasma samples were obtained by repeated centrifugation of the semen samples and then submitted to total seminal plasma protein, protein band separation (SDS-PAGE) and protein spot distribution (2D SDS-PAGE) assays. The predominant protein spots, as well as those differentially expressed between the semen collection periods, were identified using mass spectrometer (ESI-Q-ToF). In this study it was possible to observe the association of climatic variables on sperm resistance to freezing, and on the protein distribution pattern in seminal plasma. In peak conditions of the (atypical) rainfall index, higher values of kinetic parameters (except LIN) and structural and functional integrity of the plasma membrane were obtained. In the absence of extreme rain values, higher values of spermatic kinetics (except MT, LIN and BCF) were obtained in the period of lower thermal stress, estimated by the temperature and humidity index (THI). Regarding the total protein quantification of the seminal plasma, there was no difference between the periods studied, however, there was a change in the expression pattern of certain proteins. The carboxypeptidase Q proteins and albumin were more intensely expressed in the period of lower THI, whereas the fetuin B proteins, polymeric immunoglobulin receptor, acrosin binding, alpha2 macroglobulin and extracellular superoxide dismutase were more expressed in the period of higher THI (higher thermal stress). The main proteome of the seminal plasma of buffaloes was first described, the proteins with the highest expression intensity being the isoforms of the secretoglobin family, spermadesin Z13, clusterins, BSP family, albumin and zinc-alpha2-glycoproteins.