Validation of a one-tube nested real-time PCR assay for the detection of Cryptosporidium spp. in avian fecal samples / Validação da nested PCR em tempo real em um tubo para detecção de Cryptosporidium spp. em amostras fecais de aves

Abstract The aim of this study was to validate a one-tube nested real-time PCR assay followed by genetic sequencing to detect and identify Cryptosporidium species and genotypes in birds. A total of 443 genomic DNA extracted from avian fecal samples were analyzed by one-tube nested real-time PCR and conventional nested PCR. By one-tube nested real-time PCR, 90/443 (20.3%) samples were positive for Cryptosporidium spp. In contrast, 36/443 (8.1%) samples were positive for Cryptosporidium spp. by conventional nested PCR. The analytical sensitivity test showed that one-tube nested real-time PCR detects approximately 0.5 oocyst (2 sporozoites) per reaction. An evaluation of analytical specificity did not reveal amplification of microorganisms that commonly present nonspecific amplification with primers used for the diagnosis of Cryptosporidium spp. The repeatability analysis showed the same result in 27 out of 30 samples (90%). As for the reproducibility of one-tube nested real-time PCR, 24 of the 30 samples examined (80%) showed the same result. All the 90 samples amplified by one-tube real-time nested PCR were successfully sequenced, leading to the identification of C. baileyi, C. galli, C. meleagridis, C. proventriculi, and Cryptosporidium avian genotype I. Genetic sequencing of conventional nested PCR amplicons was successful in 10/36 (27.8%) of positive samples.

Resumo O objetivo deste trabalho foi validar um protocolo de nested PCR em tempo real em um tubo (nPCR-TR-1T) seguida de sequenciamento genético para detectar e caracterizar as espécies e genótipos de Cryptosporidium em aves. Um total de 443 amostras de DNA genômico, extraído de amostras fecais de aves, foi analisado pela nPCR-TR-1T e pela nested PCR convencional. Pela nPCR-TR-1T, foi observada positividade para Cryptosporidium spp. de 20,3% (90/443), em contraste com a nested PCR convencional, que apresentou positividade de 8,1% (36/443). O teste de sensibilidade analítica mostrou que a nPCR-TR-1T detecta aproximadamente 0,5 oocisto (2 esporozoítos) por reação. A avaliação da especificidade analítica não revelou amplificação de microrganismos que comumente apresentam amplificação inespecífica com primers utilizados para o diagnóstico de Cryptosporidium spp. O cálculo da repetibilidade evidenciou o mesmo resultado em 27 de 30 amostras (90%). Em relação à reprodutibilidade da nPCR-TR-1T, foi observado o mesmo resultado em 80% (24/30) das amostras examinadas. Foi possível realizar o sequenciamento em todas as 90 amostras amplificadas pela nPCR-TR-1T, com identificação de C. baileyi, C. galli, C. meleagridis, C. proventriculi e Cryptosporidium genótipo I em aves. O sequenciamento dos fragmentos amplificados pela nested PCR convencional foi possível em 10/36 (27,8%) das amostras positivas.

Eficácia dos tratamentos da pododermatite em aves

A pododermatite é uma inflamação podal que evolui para uma infecção por bactérias e fungos e acomete aves em ambiente cativo. O objetivo do tratamento da pododermatite é diminuir a inflamação/infecção, diminuir a pressão sobre o membro e remover o fator predisponente. Foram selecionados sete artigos. As terapias obtiveram regressão das lesões podais, porém nenhum artigo demonstrou a eficácia dos tratamentos, com embasamento científico, devido ao número restrito de animais utilizados. Portanto, para a determinação da eficácia dos tratamentos da pododermatite em aves seria necessária a realização de estudos clínicos randomizados e controlados. (AU)

Pododermatitis is a foot inflammation evolving into an infection by bacteria and fungi and affects birds in a captive environment. The goal of treatment of podomermatitis is to decrease inflammation / infection, decrease pressure on the limb and remove the predisposing factor. Seven articles were selected. The therapies achieved regression of the foot lesions, but no article demonstrated the effectiveness of the treatments, with scientific basis, due to the restricted number of animals used. Therefore, to determine the effectiveness of treatments of pododermatitis it would be necessary to conduct randomized and controlled clinical studies.(AU)

Eficácia dos tratamentos da pododermatite em aves

A pododermatite é uma inflamação podal que evolui para uma infecção por bactérias e fungos e acomete aves em ambiente cativo. O objetivo do tratamento da pododermatite é diminuir a inflamação/infecção, diminuir a pressão sobre o membro e remover o fator predisponente. Foram selecionados sete artigos. As terapias obtiveram regressão das lesões podais, porém nenhum artigo demonstrou a eficácia dos tratamentos, com embasamento científico, devido ao número restrito de animais utilizados. Portanto, para a determinação da eficácia dos tratamentos da pododermatite em aves seria necessária a realização de estudos clínicos randomizados e controlados.

Pododermatitis is a foot inflammation evolving into an infection by bacteria and fungi and affects birds in a captive environment. The goal of treatment of podomermatitis is to decrease inflammation / infection, decrease pressure on the limb and remove the predisposing factor. Seven articles were selected. The therapies achieved regression of the foot lesions, but no article demonstrated the effectiveness of the treatments, with scientific basis, due to the restricted number of animals used. Therefore, to determine the effectiveness of treatments of pododermatitis it would be necessary to conduct randomized and controlled clinical studies.

Prevalence of Cryptosporidium infection in domestic cats from an urban area in Brazil / Prevalência de infecção por Cryptosporidium em gatos domiciliados em uma área urbana no Brasil

We investigated the occurrence of Cryptosporidium oocysts shedding by domestic cats in an urban setting. The calculation of minimum sample size was based on an estimated prevalence of 10%, 5% absolute sampling error and a 5% significance level, resulting in 138 cats. A total of 612 owners of 2,290 cats had to be contacted for achieving the minimal sample size. In the end, only 55 owners accepted to participate in this investigation. Stool samples collected from 138 dogs were examined by microscopy using modified Kinyoun acid-fast staining, capture ELISA and nested-PCR followed by sequencing. Samples were considered positive when Cryptosporidium were detected by at least two diagnostic methods. Thirteen samples were positive (9.4%; 95% CI: 4.5 - 14.3). Cryptosporidium amplicons from seven out of the 13 samples were successfully sequenced and shared 99% genetic similarity to Cryptosporidium felis, GenBank access AF112575.1 was found. We concluded that Cryptosporidium infection is common in domestic cats from urban area and veterinary practitioners should guide cat owners to adopt preventive measures against the parasite to reduce the chance of infection in cats and householders.

Investigamos a ocorrência de eliminação de oocistos de Cryptosporidium em fezes de gatos domésticos em ambiente urbano. O cálculo do tamanho mínimo amostral baseou-se em uma prevalência estimada de 10%, erro amostral absoluto de 5% e nível de significância de 5%, resultando em 138 gatos. Um total de 612 proprietários de 2.290 gatos precisou ser contatado para atingir o tamanho mínimo amostral. No final, apenas 55 proprietários aceitaram participar dessa investigação. As amostras de fezes coletadas de 138 gatos foram examinadas por microscopia, usando coloração de Kinyoun modificada, ELISA de captura e nested-PCR, seguida de sequenciamento. As amostras foram consideradas positivas quando Cryptosporidium foi detectado por pelo menos duas técnicas de diagnóstico. Treze amostras foram positivas (9,4%; IC95%: 4,5 - 14,3). Os amplicons de Cryptosporidium de sete das 13 amostras foram sequenciados com sucesso e compartilharam 99% de similaridade genética com Cryptosporidium felis (acesso ao GenBank: AF112575.1). Concluímos que a infecção por Cryptosporidium é comum em gatos domésticos em área urbana e os médicos veterinários devem orientar os proprietários de gatos a adotarem medidas preventivas contra o parasita para reduzir a chance de infecção em gatos e humanos.

Prevalence of Cryptosporidium infection in domestic cats from an urban area in Brazil / Prevalência de infecção por Cryptosporidium em gatos domiciliados em uma área urbana no Brasil

We investigated the occurrence of Cryptosporidium oocysts shedding by domestic cats in an urban setting. The calculation of minimum sample size was based on an estimated prevalence of 10%, 5% absolute sampling error and a 5% significance level, resulting in 138 cats. A total of 612 owners of 2,290 cats had to be contacted for achieving the minimal sample size. In the end, only 55 owners accepted to participate in this investigation. Stool samples collected from 138 dogs were examined by microscopy using modified Kinyoun acid-fast staining, capture ELISA and nested-PCR followed by sequencing. Samples were considered positive when Cryptosporidium were detected by at least two diagnostic methods. Thirteen samples were positive (9.4%; 95% CI: 4.5 - 14.3). Cryptosporidium amplicons from seven out of the 13 samples were successfully sequenced and shared 99% genetic similarity to Cryptosporidium felis, GenBank access AF112575.1 was found. We concluded that Cryptosporidium infection is common in domestic cats from urban area and veterinary practitioners should guide cat owners to adopt preventive measures against the parasite to reduce the chance of infection in cats and householders.(AU)

Investigamos a ocorrência de eliminação de oocistos de Cryptosporidium em fezes de gatos domésticos em ambiente urbano. O cálculo do tamanho mínimo amostral baseou-se em uma prevalência estimada de 10%, erro amostral absoluto de 5% e nível de significância de 5%, resultando em 138 gatos. Um total de 612 proprietários de 2.290 gatos precisou ser contatado para atingir o tamanho mínimo amostral. No final, apenas 55 proprietários aceitaram participar dessa investigação. As amostras de fezes coletadas de 138 gatos foram examinadas por microscopia, usando coloração de Kinyoun modificada, ELISA de captura e nested-PCR, seguida de sequenciamento. As amostras foram consideradas positivas quando Cryptosporidium foi detectado por pelo menos duas técnicas de diagnóstico. Treze amostras foram positivas (9,4%; IC95%: 4,5 - 14,3). Os amplicons de Cryptosporidium de sete das 13 amostras foram sequenciados com sucesso e compartilharam 99% de similaridade genética com Cryptosporidium felis (acesso ao GenBank: AF112575.1). Concluímos que a infecção por Cryptosporidium é comum em gatos domésticos em área urbana e os médicos veterinários devem orientar os proprietários de gatos a adotarem medidas preventivas contra o parasita para reduzir a chance de infecção em gatos e humanos.(AU)

Detection and molecular characterization of Cryptosporidium spp. in captive canaries (Serinus canaria) using different diagnostic methods

This study used several diagnostic methods to examine the occurrence of and molecularly characterize Cryptosporidium spp. in captive canaries (Serinus canaria) in southern and southeastern Brazil. A total of 498 fecal samples were purified by centrifugal-flotation using Sheather's solution. Cryptosporidium spp. diagnosis was performed using three diagnostic methods: malachite green negative staining, nested PCR targeting the 18S rRNA gene, followed by sequencing the amplified fragments, and duplex real-time PCR targeting the 18S rRNA specific to detect Cryptosporidium galli and Cryptosporidium avian genotype III. The overall positivity for Cryptosporidium spp. (total samples positive in at least one protocol) from the microscopic analysis, nested PCR and duplex real-time PCR protocol results was 13.3% (66/498). The positivity rates were 2.0% (10/498) and 4.6% (23/498) for Cryptosporidium spp. by microscopy and nested PCR, respectively. Sequencing of 20 samples amplified by nested PCR identified C. galli (3.0%; 15/498), Cryptosporidium avian genotype I (0.8%; 4/498) and Cryptosporidium avium (0.2%; 1/498). Duplex real-time PCR revealed a positivity of 7.8% (39/498) for C. galli and 2.4% (12/498) for avian genotype III. Malachite green negative staining differed significantly from nested PCR in detecting Cryptosporidium spp. Duplex real-time PCR was more sensitive than nested PCR/sequencing for detecting gastric Cryptosporidium in canaries.(AU)

Este trabalho teve como objetivos determinar a ocorrência e realizar a caracterização molecular de Cryptosporidium spp. em 498 amostras fecais de canários (Serinus canaria) criados em cativeiro, utilizando três métodos de diagnóstico: análise microscópica pela coloração negativa com verde malaquita, nested PCR seguida de sequenciamento dos fragmentos amplificados e PCR duplex em tempo real específica para detecção de Cryptosporidium galli e Cryptosporidium genótipo III de aves. A positividade total para Cryptosporidium spp. (total de amostras positivas em pelo menos um método de diagnóstico) obtida pela análise microscópica, nested PCR e PCR duplex em tempo real foi de 13,3% (66/498). As taxas de positividade para Cryptosporidium spp. foram 2,0% (10/498) e 4,6% (23/498) por microscopia e nested PCR, respectivamente. O sequenciamento de 20 amostras amplificadas pela nested PCR identificou C. galli (3,0%; 15/498), Cryptosporidium genótipo I de aves (0,8%; 4/498) e Cryptosporidium avium (0,2%; 1/498). A PCR duplex em tempo real revelou positividade de 7,8% (39/498) para C. galli e 2,4% (12/498) para Cryptosporidium genótipo III de aves. A análise microscópica diferiu significativamente da nested PCR para detecção de Cryptosporidium spp. A PCR duplex em tempo real apresentou maior sensibilidade que a nested PCR/sequenciamento para detectar as espécies/genótipos gástricos de Cryptosporidium.(AU)

Detection and molecular characterization of Cryptosporidium spp. in captive canaries (Serinus canaria) using different diagnostic methods / Detecção e caracterização molecular de Cryptosporidium spp. em canários mantidos em cativeiro (Serinus canaria) por diferentes métodos de diagnóstico

This study used several diagnostic methods to examine the occurrence of and molecularly characterize Cryptosporidium spp. in captive canaries (Serinus canaria) in southern and southeastern Brazil. A total of 498 fecal samples were purified by centrifugal-flotation using Sheather's solution. Cryptosporidium spp. diagnosis was performed using three diagnostic methods: malachite green negative staining, nested PCR targeting the 18S rRNA gene, followed by sequencing the amplified fragments, and duplex real-time PCR targeting the 18S rRNA specific to detect Cryptosporidium galli and Cryptosporidium avian genotype III. The overall positivity for Cryptosporidium spp. (total samples positive in at least one protocol) from the microscopic analysis, nested PCR and duplex real-time PCR protocol results was 13.3% (66/498). The positivity rates were 2.0% (10/498) and 4.6% (23/498) for Cryptosporidium spp. by microscopy and nested PCR, respectively. Sequencing of 20 samples amplified by nested PCR identified C. galli (3.0%; 15/498), Cryptosporidium avian genotype I (0.8%; 4/498) and Cryptosporidium avium (0.2%; 1/498). Duplex real-time PCR revealed a positivity of 7.8% (39/498) for C. galli and 2.4% (12/498) for avian genotype III. Malachite green negative staining differed significantly from nested PCR in detecting Cryptosporidium spp. Duplex real-time PCR was more sensitive than nested PCR/sequencing for detecting gastric Cryptosporidium in canaries.(AU)

Este trabalho teve como objetivos determinar a ocorrência e realizar a caracterização molecular de Cryptosporidium spp. em 498 amostras fecais de canários (Serinus canaria) criados em cativeiro, utilizando três métodos de diagnóstico: análise microscópica pela coloração negativa com verde malaquita, nested PCR seguida de sequenciamento dos fragmentos amplificados e PCR duplex em tempo real específica para detecção de Cryptosporidium galli e Cryptosporidium genótipo III de aves. A positividade total para Cryptosporidium spp. (total de amostras positivas em pelo menos um método de diagnóstico) obtida pela análise microscópica, nested PCR e PCR duplex em tempo real foi de 13,3% (66/498). As taxas de positividade para Cryptosporidium spp. foram 2,0% (10/498) e 4,6% (23/498) por microscopia e nested PCR, respectivamente. O sequenciamento de 20 amostras amplificadas pela nested PCR identificou C. galli (3,0%; 15/498), Cryptosporidium genótipo I de aves (0,8%; 4/498) e Cryptosporidium avium (0,2%; 1/498). A PCR duplex em tempo real revelou positividade de 7,8% (39/498) para C. galli e 2,4% (12/498) para Cryptosporidium genótipo III de aves. A análise microscópica diferiu significativamente da nested PCR para detecção de Cryptosporidium spp. A PCR duplex em tempo real apresentou maior sensibilidade que a nested PCR/sequenciamento para detectar as espécies/genótipos gástricos de Cryptosporidium.(AU)

Evaluation of recombinant Cryptosporidium hominis GP60 protein and anti-GP60 chicken polyclonal IgY for research and diagnostic purposes / Avaliação da proteína recombinante GP60 de Cryptosporidium hominis e da IgY policlonal anti-GP60 recombinante para uso em pesquisa e diagnóstico

In this study, a method for expressing Cryptosporidium hominis GP60 glycoprotein in Escherichia coli for production of polyclonal anti-GP60 IgY in chickens was developed aiming future studies concerning the diagnosis, prevention and treatment of cryptosporidiosis. The full-length nucleotide sequence of the C. hominis gp60 gene was codon-optimized for expression in E. coli and was synthesized in pET28-a vector. Subcloning was performed on several different strains of BL21 E. coli. Temperature, time and inducer IPTG concentration assays were also performed and analyzed using SDS-PAGE. The optimal conditions were observed at a temperature of 37 °C, with overnight incubation and 1 mM of IPTG. Purification was performed by means of affinity chromatography using the AKTA Pure chromatography system and the Hi-Trap HP column (GE Healthcare). The recombinant protein GP60 (rGP60) thus generated was used to immunize laying hens owing the production of polyclonal IgY. Western blot and indirect immunofluorescence showed that the polyclonal antibody was capable of binding to rGP60 and to Cryptosporidium parvum sporozoites, respectively. The rGP60 and the IgY anti-rGP60 generated in this study may be used as templates for research and for the development of diagnostic methods for cryptosporidiosis.(AU)

Neste trabalho, foi desenvolvido um método de expressão da glicoproteína GP60 de Cryptosporidium hominis em Escherichia coli visando produzir anticorpos IgY anti-GP60 em galinhas para utilização em estudos futuros com os objetivos de diagnóstico, prevenção e tratamento da criptosporidiose. A sequência completa de nucleotídeos do gene gp60 de C. hominis foi códon-otimizada para expressão em E. coli e sintetizada no vetor pET28-a. A subclonagem foi realizada em várias estirpes diferentes de E. coli BL21. Os ensaios de concentração do indutor IPTG, temperatura e tempo foram realizados e analisados por SDS-PAGE. As condições ótimas de expressão foram observadas em temperatura de 37 °C, incubação durante a noite e 1 mM de IPTG. A purificação da proteína foi realizada por cromatografia de afinidade utilizando o sistema de cromatografia AKTA Pure e a coluna Hi-Trap HP (GE Healthcare). A proteína recombinante GP60 (rGP60) foi utilizada para imunizar galinhas poedeiras para produzir IgY policlonal anti-rGP60. Verificou-se por Western blot e por imunofluorescência indireta que o anticorpo policlonal apresentou reatividade com a rGP60 e com esporozoítos de Cryptosporidium parvum, respectivamente. A rGP60 e a IgY anti-rGP60 geradas neste estudo podem ser utilizadas como modelos para o desenvolvimento de ensaios para pesquisa e diagnóstico da criptosporidiose.(AU)

Occurrence of Cryptosporidium spp. and Giardia spp. in pigs at weaning / Ocorrência de Cryptosporidium spp. and Giardia spp. em suínos ao desmame

Cryptosporidium spp. and Giardia spp. are parasites and have been reported in many species of mammals, including humans. The goal of this research was to investigate the occurrence of Cryptosporidium spp. and Giardia spp. in 45-days-old pigs. Fecal samples of 107 pigs were collected at three alternate days in piggeries in Araçatuba, São Paulo State, Brazil. Cryptosporidium oocysts were observed in 4.7% (5/107) of animals by Kinyoun acid-fast stain method and cysts of Giardia spp. were observed in 1.9% (2/107) of the animals by the method of Faust. Of all animals, 85 presented feces with normal consistency and 22 showed diarrhea in at least one collection. Two diarrheic samples showed positivity for both Cryptosporidium spp. and Giardia spp. From these results it is possible to infer that the occurrence of Cryptosporidium and Giardia was low because of the good management practices and both protozoa were not associated the presence of symptoms.

Cryptosporidium spp. e Giardia spp. são parasitas e têm sido relatados em várias espécies de mamíferos, incluindo humanos. O objetivo deste trabalho foi investigar a ocorrência de Cryptosporidium spp. e Giardia spp. em suínos de 45 dias de idade. Amostras fecais de 107 suínos foram coletadas em três dias alternados de pocilgas em Araçatuba, São Paulo, Brasil. Oocistos de Cryptosporidium foram observados em 4,7% (5/107) dos animais por meio do método de Kinyoun e cistos de Giardia spp. em 1,9% (2/107) dos animais pelo método de Faust. Dentre os animais, 85 apresentaram fezes com consistência normal e 22 com diarréia em pelo menos uma coleta. Em duas amostras diarreicas foram observadas presença de oocistos de Cryptosporidium spp. e cistos de Giardia spp. A partir destes resultados é possível inferir que a ocorrência de Cryptosporidium e Giardia foi baixa devido a práticas de boa gestão e que ambos os protozoários não foram associados à presença de sintomas.

Occurrence of Cryptosporidium spp. and Giardia spp. in pigs at weaning / Ocorrência de Cryptosporidium spp. and Giardia spp. em suínos ao desmame

Cryptosporidium spp. and Giardia spp. are parasites and have been reported in many species of mammals, including humans. The goal of this research was to investigate the occurrence of Cryptosporidium spp. and Giardia spp. in 45-days-old pigs. Fecal samples of 107 pigs were collected at three alternate days in piggeries in Araçatuba, São Paulo State, Brazil. Cryptosporidium oocysts were observed in 4.7% (5/107) of animals by Kinyoun acid-fast stain method and cysts of Giardia spp. were observed in 1.9% (2/107) of the animals by the method of Faust. Of all animals, 85 presented feces with normal consistency and 22 showed diarrhea in at least one collection. Two diarrheic samples showed positivity for both Cryptosporidium spp. and Giardia spp. From these results it is possible to infer that the occurrence of Cryptosporidium and Giardia was low because of the good management practices and both protozoa were not associated the presence of symptoms.(AU)

Cryptosporidium spp. e Giardia spp. são parasitas e têm sido relatados em várias espécies de mamíferos, incluindo humanos. O objetivo deste trabalho foi investigar a ocorrência de Cryptosporidium spp. e Giardia spp. em suínos de 45 dias de idade. Amostras fecais de 107 suínos foram coletadas em três dias alternados de pocilgas em Araçatuba, São Paulo, Brasil. Oocistos de Cryptosporidium foram observados em 4,7% (5/107) dos animais por meio do método de Kinyoun e cistos de Giardia spp. em 1,9% (2/107) dos animais pelo método de Faust. Dentre os animais, 85 apresentaram fezes com consistência normal e 22 com diarréia em pelo menos uma coleta. Em duas amostras diarreicas foram observadas presença de oocistos de Cryptosporidium spp. e cistos de Giardia spp. A partir destes resultados é possível inferir que a ocorrência de Cryptosporidium e Giardia foi baixa devido a práticas de boa gestão e que ambos os protozoários não foram associados à presença de sintomas.(AU)

Mello and Campos (1974) method adapted for the recovery of cestodes in birds (Gallus domesticus) / Método Mello e Campos (1974) adaptado para recuperação de cestódeos de aves (Gallus domesticus)

The specific diagnosis and evaluation of the intensity of avian helminth infections are essential for efficacy studies and the determination of drug doses targeted to their control. This study evaluated the Mello and Campos method, originally described for parasitological diagnosis in dogs, in the recovery of scolices from cestode parasites of poultry (Gallus domesticus). A total of 52 naturally infected birds obtained from farms underwent parasitological necropsy using the Mello and Campos method. The method consisted of four steps: content, soaking, scraping and evaluation. The number of scolices recovered per bird ranged from 1 to 4,345, and the highest number of scolices was recovered from material derived from the soaking step. The cestodes species diagnosed were Amoebotaenia cuneata, Choanotaenia infundibulum, Hymenolepis sp., Raillietina tetragona, Raillietina echinobothrida and Raillietina cesticillus. The  Mello and Campos method, originally used to test for helminths in dogs, was effective in avian cestode testing because it includes a soaking step, which enables a more efficient recovery of scolices.

O diagnóstico específico e a avaliação da intensidade da infecção helmíntica em aves são fundamentais em estudos de eficácia e determinação de doses de medicamentos direcionados ao seu controle. O presente trabalho avaliou a aplicação e adaptação da metodologia de Mello e Campos, descrita originalmente para diagnóstico parasitológico em cães, na recuperação de escólices de cestódeos parasitos de aves domésticas (Gallus domesticus). Foram empregadas 52 aves naturalmente infectadas e oriundas de produções rurais, as quais foram submetidas à necropsia parasitológica, adaptando-se a metodologia Mello e Campos. O método consistiu na realização de quatro etapas: conteúdo, imersão, raspado e avaliação. O número de escólices recuperadas por ave variou de 1 a 4.345, e o maior número de escólices foi recuperado do material oriundo da etapa de imersão. As espécies de cestódeos identificadas foram Amoebotaenia cuneata, Choanotaenia infundibulum, Hymenolepis sp., Raillietina tetragona, Raillietina echinobothrida e Raillietina cesticillus. Os resultados foram avaliados estatisticamente, concluindo-se que a metodologia adotada é eficaz para a recuperação de cestódeos de aves, uma vez que possui a etapa de imersão, que permite a recuperação mais eficiente de escólices.

Mello and Campos (1974) method adapted for the recovery of cestodes in birds ( Gallus domesticus ) / Método Mello e Campos (1974) adaptado para recuperação de cestódeos de aves (Gallus domesticus)

The specific diagnosis and evaluation of the intensity of avian helminth infections are essential for efficacy studies and the determination of drug doses targeted to their control. This study evaluated the Mello and Campos method, originally described for parasitological diagnosis in dogs, in the recovery of scolices from cestode parasites of poultry (Gallus domesticus ). A total of 52 naturally infected birds obtained from farms underwent parasitological necropsy using the Mello and Campos method. The method consisted of four steps: content, soaking, scraping and evaluation. The number of scolices recovered per bird ranged from 1 to 4,345, and the highest number of scolices was recovered from material derived from the soaking step. The cestodes species diagnosed were Amoebotaenia cuneata , Choanotaenia infundibulum , Hymenolepis sp., Raillietina tetragona , Raillietina echinobothrida and Raillietina cesticillus . The Mello and Campos method, originally used to test for helminths in dogs, was effective in avian cestode testing because it includes a soaking step, which enables a more efficient recovery of scolices.(AU)

O diagnóstico específico e a avaliação da intensidade da infecção helmíntica em aves são fundamentais em estudos de eficácia e determinação de doses de medicamentos direcionados ao seu controle. O presente trabalho avaliou a aplicação e adaptação da metodologia de Mello e Campos, descrita originalmente para diagnóstico parasitológico em cães, na recuperação de escólices de cestódeos parasitos de aves domésticas (Gallus domesticus ). Foram empregadas 52 aves naturalmente infectadas e oriundas de produções rurais, as quais foram submetidas à necropsia parasitológica, adaptando-se a metodologia Mello e Campos. O método consistiu na realização de quatro etapas: conteúdo, imersão, raspado e avaliação. O número de escólices recuperadas por ave variou de 1 a 4.345, e o maior número de escólices foi recuperado do material oriundo da etapa de imersão. As espécies de cestódeos identificadas foram Amoebotaenia cuneata , Choanotaenia infundibulum , Hymenolepis sp., Raillietina tetragona , Raillietina echinobothrida e Raillietina cesticillus . Os resultados foram avaliados estatisticamente, concluindo-se que a metodologia adotada é eficaz para a recuperação de cestódeos de aves, uma vez que possui a etapa de imersão, que permite a recuperação mais eficiente de escólices.(AU)

Mello and Campos (1974) method adapted for the recovery of cestodes in birds (Gallus domesticus) / Método Mello e Campos (1974) adaptado para recuperação de cestódeos de aves (Gallus domesticus)

The specific diagnosis and evaluation of the intensity of avian helminth infections are essential for efficacy studies and the determination of drug doses targeted to their control. This study evaluated the Mello and Campos method, originally described for parasitological diagnosis in dogs, in the recovery of scolices from cestode parasites of poultry (Gallus domesticus). A total of 52 naturally infected birds obtained from farms underwent parasitological necropsy using the Mello and Campos method. The method consisted of four steps: content, soaking, scraping and evaluation. The number of scolices recovered per bird ranged from 1 to 4,345, and the highest number of scolices was recovered from material derived from the soaking step. The cestodes species diagnosed were Amoebotaenia cuneata, Choanotaenia infundibulum, Hymenolepis sp., Raillietina tetragona, Raillietina echinobothrida and Raillietina cesticillus. The  Mello and Campos method, originally used to test for helminths in dogs, was effective in avian cestode testing because it includes a soaking step, which enables a more efficient recovery of scolices.(AU)

O diagnóstico específico e a avaliação da intensidade da infecção helmíntica em aves são fundamentais em estudos de eficácia e determinação de doses de medicamentos direcionados ao seu controle. O presente trabalho avaliou a aplicação e adaptação da metodologia de Mello e Campos, descrita originalmente para diagnóstico parasitológico em cães, na recuperação de escólices de cestódeos parasitos de aves domésticas (Gallus domesticus). Foram empregadas 52 aves naturalmente infectadas e oriundas de produções rurais, as quais foram submetidas à necropsia parasitológica, adaptando-se a metodologia Mello e Campos. O método consistiu na realização de quatro etapas: conteúdo, imersão, raspado e avaliação. O número de escólices recuperadas por ave variou de 1 a 4.345, e o maior número de escólices foi recuperado do material oriundo da etapa de imersão. As espécies de cestódeos identificadas foram Amoebotaenia cuneata, Choanotaenia infundibulum, Hymenolepis sp., Raillietina tetragona, Raillietina echinobothrida e Raillietina cesticillus. Os resultados foram avaliados estatisticamente, concluindo-se que a metodologia adotada é eficaz para a recuperação de cestódeos de aves, uma vez que possui a etapa de imersão, que permite a recuperação mais eficiente de escólices.(AU)

Cryptosporidium infections in birds - a review / Infecção por Cryptosporidium em aves - uma revisão

Cryptosporidiosis is one of the main protozoan infections in birds. It manifests as either a respiratory or a digestive illness, and it affects a very large number of avian species across several continents. The aim of this review is to report on the main results of studies on cryptosporidiosis among birds and the importance of these results to veterinary medicine and public health.(AU)

A criptosporidiose constitui-se em uma das principais infecções por protozoários em aves, manifestando-se como enfermidade respiratória ou digestiva, em dezenas de espécies aviárias, em vários continentes. O objetivo desse trabalho foi relatar, por meio de revisão de literatura, os principais resultados de estudos sobre criptosporidiose em aves e sua importância para a medicina veterinária e saúde pública.(AU)

Pesquisa de oocistos de Isospora spp. Em passeriformes criados em cativeiro / Screening for Isospora spp. Oocysts in passeriformes raised in captivity

This study aimed to research the long-term shedding of Isospora spp. oocysts in several species of passerines naturally infected and kept in captivity. Two hundred and eighty-nine fecal samples were collected from two flocks with previous diagnosis of isosporosis, in which several adult passerine species were raised. Samples were collected individually, monthly, for 13 months, purified in Sheathers sugar solution and examined using microscopy. Of the 289 samples, 159 (55.02%) were positive for Isospora spp.  oocysts and 130 (44.98%) were negative. Most of the birds analyzed shed oocysts in small quantity (score 1), intermittently and for a long period.  Despite the occurrence of Isospora infection, the birds that were analysed showed no clinical isosporosis. The results of this research provide data for the control of isosporosis in passerines raised in captivity. The decisions about performing prophylactic or curative treatment, as well as decisions related to hygiene and sanitary measures must take into account not only the presence of the parasite in feces, but also the intensity of oocysts shedding, as well as evaluation of sanitary and nutritional management and the presence of clinical signs and/or mortality.

O presente estudo teve como objetivo pesquisar, em longo prazo, a presença de oocistos de Isospora spp. em várias espécies de passeriformes, naturalmente infectadas, criadas em cativeiro. Foram colhidas 289 amostras em dois criatórios de passeriformes, onde houve comprovação prévia de infecção por Isospora, nos quais havia alojamento de várias espécies de passeriformes adultos. As amostras foram colhidas de forma individual, com periodicidade mensal, por 13 meses, purificadas em solução de Sheather e examinadas por microscopia. Das 289 amostras, 159 (55,02%) apresentaram positividade para oocistos de Isospora e 130 (44,98%) foram negativas. Na maioria das aves analisadas foi observada eliminação de oocistos, em pequena quantidade, intermitente e por período prolongado. Apesar de todas as aves apresentarem oocistos de Isospora nas fezes pelo menos uma vez, em um período de 13 meses, as aves não apresentaram isosporose clínica. Os resultados observados neste experimento fornecem dados para o controle da isosporose em passeriformes criados em cativeiro.Asdecisões sobre a realização de tratamento profilático oucurativo, assim como sobre medidas higiênico-sanitárias a serem adotadas devem levar em consideração não somente a presença de parasito em fezes, mas também a intensidade de eliminação de oocistos, sim como aavaliação do manejo higiênico sanitário e nutricional e a presença de sinais clínicos e/ou de mortalidade.

Pesquisa de oocistos de Isospora spp. em passeriformes criados em cativeiro

This study aimed to research the long-term shedding of Isospora spp. oocysts in several species of passerines naturally infected and kept in captivity. Two hundred and eighty-nine fecal samples were collected from two flocks with previous diagnosis of isosporosis, in which several adult passerine species were raised. Samples were collected individually, monthly, for 13 months, purified in Sheather's sugar solution and examined using microscopy. Of the 289 samples, 159 (55.02%) were positive for Isospora spp. oocysts and 130 (44.98%) were negative. Most of the birds analyzed shed oocysts in small quantity (score 1), intermittently and for a long period. Despite the occurrence of Isospora infection, the birds that were analysed showed no clinical isosporosis. The results of this research provide data for the control of isosporosis in passerines raised in captivity. The decisions about performing prophylactic or curative treatment, as well as decisions related to hygiene and sanitary measures must take into account not only the presence of the parasite in feces, but also the intensity of oocysts shedding, as well as evaluation of sanitary and nutritional management and the presence of clinical signs and/or mortality.

O presente estudo teve como objetivo pesquisar, em longo prazo, a presença de oocistos de Isospora spp. em várias espécies de passeriformes, naturalmente infectadas, criadas em cativeiro. Foram colhidas 289 amostras em dois criatórios de passeriformes, onde houve comprovação prévia de infecção por Isospora, nos quais havia alojamento de várias espécies de passeriformes adultos. As amostras foram colhidas de forma individual, com periodicidade mensal, por 13 meses, purificadas em solução de Sheather e examinadas por microscopia. Das 289 amostras, 159 (55,02%) apresentaram positividade para oocistos de Isospora e 130 (44,98%) foram negativas. Na maioria das aves analisadas foi observada eliminação de oocistos, em pequena quantidade, intermitente e por período prolongado. Apesar de todas as aves apresentarem oocistos de Isospora nas fezes pelo menos uma vez, em um período de 13 meses, as aves não apresentaram isosporose clínica. Os resultados observados neste experimento fornecem dados para o controle da isosporose em passeriformes criados em cativeiro. As decisões sobre a realização de tratamento profilático ou curativo, assim como sobre medidas higiênico-sanitárias a serem adotadas devem levar em consideração não somente a presença de parasito em fezes, mas também a intensidade de eliminação de oocistos, ssim como a avaliação do manejo higiênico sanitário e nutricional e a presença de sinais clínicos e/ou de mortalidade.

Pesquisa de oocistos de Isospora spp. Em passeriformes criados em cativeiro / Screening for Isospora spp. Oocysts in passeriformes raised in captivity

This study aimed to research the long-term shedding of Isospora spp. oocysts in several species of passerines naturally infected and kept in captivity. Two hundred and eighty-nine fecal samples were collected from two flocks with previous diagnosis of isosporosis, in which several adult passerine species were raised. Samples were collected individually, monthly, for 13 months, purified in Sheathers sugar solution and examined using microscopy. Of the 289 samples, 159 (55.02%) were positive for Isospora spp.  oocysts and 130 (44.98%) were negative. Most of the birds analyzed shed oocysts in small quantity (score 1), intermittently and for a long period.  Despite the occurrence of Isospora infection, the birds that were analysed showed no clinical isosporosis. The results of this research provide data for the control of isosporosis in passerines raised in captivity. The decisions about performing prophylactic or curative treatment, as well as decisions related to hygiene and sanitary measures must take into account not only the presence of the parasite in feces, but also the intensity of oocysts shedding, as well as evaluation of sanitary and nutritional management and the presence of clinical signs and/or mortality.(AU)

O presente estudo teve como objetivo pesquisar, em longo prazo, a presença de oocistos de Isospora spp. em várias espécies de passeriformes, naturalmente infectadas, criadas em cativeiro. Foram colhidas 289 amostras em dois criatórios de passeriformes, onde houve comprovação prévia de infecção por Isospora, nos quais havia alojamento de várias espécies de passeriformes adultos. As amostras foram colhidas de forma individual, com periodicidade mensal, por 13 meses, purificadas em solução de Sheather e examinadas por microscopia. Das 289 amostras, 159 (55,02%) apresentaram positividade para oocistos de Isospora e 130 (44,98%) foram negativas. Na maioria das aves analisadas foi observada eliminação de oocistos, em pequena quantidade, intermitente e por período prolongado. Apesar de todas as aves apresentarem oocistos de Isospora nas fezes pelo menos uma vez, em um período de 13 meses, as aves não apresentaram isosporose clínica. Os resultados observados neste experimento fornecem dados para o controle da isosporose em passeriformes criados em cativeiro.Asdecisões sobre a realização de tratamento profilático oucurativo, assim como sobre medidas higiênico-sanitárias a serem adotadas devem levar em consideração não somente a presença de parasito em fezes, mas também a intensidade de eliminação de oocistos, sim como aavaliação do manejo higiênico sanitário e nutricional e a presença de sinais clínicos e/ou de mortalidade. (AU)

Ocorrência da infecção por Cryptosporidium spp. em cabritos (Capra hircus) / Occurrence of infection by Cryptosporidium spp. in goat kids (Capra hircus)

O presente estudo teve como objetivo determinar a ocorrência da infecção por Cryptosporidium spp. em cabritos de Quixadá, Ceará, Brasil. Participaram do estudo 400 cabritos, com idade entre três e 360 dias, de ambos os sexos, com e sem padrão racial definido, procedentes de 25 estabelecimentos rurais distribuídos em três circuitos. As fezes foram cadastradas de acordo com o aspecto e cor, distribuídas em tubos tipo "eppendorf®" e congeladas in natura a -20°C, até o momento das extrações de DNA genômico do parasito com auxílio de kit comercial. Para amplificação de fragmentos da subunidade 18S do RNA ribossômico (rRNA) foi utilizada a "Nested"-PCR. A ocorrência de Cryptosporidium spp em cabritos de Quixadá foi de 7,50% (30/400). A frequência no período seco e no chuvoso foi de 9,55% (19/199) e 5,47% (11/201), respectivamente (χ²=2,39 e P>0,05). Amostras positivas foram identificadas em 64,00% (16/25) das propriedades estudadas e dessas amostras 50,00% (15/30) e 70,00% (21/30) tinham as fezes com aspecto e cor normais, respectivamente, sugerindo que cabritos assintomáticos estão eliminando oocistos. Não foi observada positividade para Cryptosporidium spp. em animais com 301 a 360 dias, demonstrando que animais mais velhos apresentam menos possibilidade de se infectarem com o parasito.(AU)

The present study aimed to determine the occurrence of infection by Cryptosporidium spp. in goat kids from Quixadá, Ceará, Brazil. The study included 400 goat kids of both sexes, 3 to 360 days old, with or without defined breed, originating from 25 farms distributed in three circuits. Feces were registered in accordance with the appearance and color, distributed into tubes Eppendorf tubes and frozen in natura at-20°C until the moment of extraction of genomic DNA from the parasite with the aid of a commercial kit. For amplification of fragments of the 18S subunit of ribosomal RNA (rRNA) was used to Nested PCR. The occurrence of Cryptosporidium spp. in goats kids of the Quixadá was 7.50% (30/400). The frequency in the dry period and rainy was 9.55% (19/199) and 5.47% (11/201) respectively (χ²=2.39 and P>0.05). Positive samples were identified in 64.00% (16/25) of the studied farms, and from these samples 50.00% (15/30) and 70.00% (21/30) had feces with normal appearance and color respectively, suggesting that the asymptomatic goats were eliminating oocysts. No positivity for Cryptosporidium spp. was observed in 301 to 360-day-old goats, demonstrating that older animals have less chance to become infected with the parasite.(AU)

Cryptosporidium spp. infection in mares and foals of the northwest region of São Paulo State, Brazil / Infecção por Cryptosporidium spp. em éguas e potros da região noroeste do estado de São Paulo, Brasil

The present study aimed to analyze the occurrence of infection by Cryptosporidium spp. in mares and their respective foals. This study was carried out in 11 farms located in the municipalities of Araçatuba, Birigui, Guararapes and Santo Antônio do Aracangua, in the northwest region of the State of Sao Paulo, from November 2010 to March 2011. A total of 98 mares and 98 foals of several breeds were analyzed; among foals, 59 were males and 39 females, aged from three to 330 days. Feces were collected directly from the rectal ampulla, purified and processed according to modified Kinyoun stain. Occurrence of Cryptosporidium spp. was 21.4% (21/98) for foals and 18.4% (18/98) for mares. Occurrence of Cryptosporidium spp. had significant association with breeds and age of animals. Results obtained led to the conclusion that foals older than two months and Mangalarga animals are less susceptible to the occurrence of Cryptosporidium spp(AU)

O presente estudo teve como objetivo analisar a ocorrência da infecção por Cryptosporidium spp. em éguas e seus respectivos potros. Este estudo foi realizado em 11 fazendas localizadas nos municípios de Araçatuba, Birigui, Guararapes e Santo Antônio do Aracangua, na região Noroeste do Estado de São Paulo, de novembro de 2010 a março de 2011. Um total de 98 éguas e 98 potros de diversas raças foram analisados, sendo que, entre os filhotes, 59 eram machos e 39 fêmeas, cujas idades variavam de três até 330 dias. Fezes foram colhidas diretamente da ampola retal, purificadas e processadas pela técnica de Kinyoun modificada. A ocorrência de Cryptosporidium spp. observada foi de 21,4% (21/98) para potros e 18,4% (18/98) para éguas. A ocorrência de Cryptosporidium spp. teve uma associação significativa com a raça e a idade dos animais. A partir dos resultados obtidos, conclui-se neste estudo que potros com idade superior a dois meses e animais da raça Mangalarga foram menos susceptíveis à ocorrência de Cryptosporidium spp(AU)

Detection of Cryptosporidium parvum oocysts in calf fecal samples by direct immunofluorescence assay / Detecção de oocistos de Cryptosporidium parvum em amostras fecais de bezerros pela reação de imunofluorescência direta

The aim of this study was to produce a conjugate containing anti-Cryptosporidium parvum polyclonal antibodies and standardize a Direct Immunofluorescence Assay (DIF) for detecting C. parvum oocysts in fecal samples from calves. In order to obtain anti-C. parvum polyclonal antibodies, two New Zealand rabbits were immunized with a purified solution of C. parvum oocysts and Freund's adjuvant. Purification of the immunoglobulin G (IgG) fraction was performed by means of precipitation in ammonium sulfate and chromatography using a DEAE-cellulose column. The anti-C. parvum polyclonal antibody titer was determined by means of the enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). The rabbit anti-C. parvum IgG fraction was conjugated with fluorescein isothiocyanate and standardization of the DIF was performed using various dilutions of conjugate on slides positive for C. parvum oocysts. The cross-reactivity of the anti-C. parvum conjugate was tested using oocysts of Cryptosporidium serpentis, Cryptosporidium andersoni, Escherichia coli, Eimeria sp., and Candida sp. An anti-C. parvum conjugate was successfully produced, thus allowing standardization of DIF for detection of Cryptosporidium oocysts in fecal samples. Cross-reactivity of anti-C. parvum polyclonal antibodies with C. andersoni and C. serpentis was also observed.(AU)

O objetivo deste estudo foi produzir um conjugado contendo anticorpos policlonais anti-Cryptosporidium parvum e padronizar a Reação de Imunofluorescência Direta (RID), para detecção de oocistos de C. parvum em amostras fecais de bezerros. Para produção de anticorpos policlonais anti-C. parvum, dois coelhos da raça Nova Zelândia foram imunizados com uma solução purificada de oocistos de C. parvum e adjuvante de Freund. A purificação da fração de imunoglobulina G (IgG) foi realizada por meio de precipitação em sulfato de amônio e cromatografia em coluna de DEAE celulose. A titulação dos anticorpos policlonais anti-C. parvum foi determinada por meio de ensaio imunoenzimático (ELISA). A fração IgG de coelho anti-C. parvum foi conjugada com isotiocianato de fluoresceína, e a padronização da RID foi feita utilizando-se várias diluições do conjugado, em lâminas positivas para C. parvum. Foi pesquisada também a presença de reatividade cruzada do conjugado anti-C. parvum com C. serpentis, C. andersoni, Escherichia coli, Eimeria sp. e Candida sp.. A produção do conjugado anti-C. parvum foi bem sucedida, sendo possível a padronização da RID para detecção de oocistos em fezes. Foi também observada reatividade cruzada dos anticorpos policlonais anti-C. parvum, com C. andersoni e C. serpentis.(AU)