Resumo
An alkaliphilic and salt- tolerant actinomycete, Streptomyces clavuligerus strain Mit-1, was isolated from Mithapur, the western coast of India. The organism was Gram-positive, having filamentous, long thread like structure. The sporulation started after two days of growth and the optimum level of alkaline protease (130 U/ml) was produced during the early stationary phase. The strain could grow and produce protease with 0-10% NaCl (w/v), the optimum being 5% NaCl (w/v). Growth and protease production was optimum at pH 9 with substantial decline at neutral pH. Sucrose and gelatin were the best carbon and nitrogen sources respectively, whereas gelatin broth was the preferred medium for protease production. Mit-1 produced substantial protease with various amino acids, when employed as the sole nitrogen sources. Crude substrates, such as molasses, whey and wheat flour had significant effect on enzyme production. The results are quite valuable, as only few actinomycetes, particularly salt-tolerant alkaliphilic ones, have so far been explored for their enzymatic potential and process optimization.
Uma cepa halotolerante e alcalifílica de Streptomyces clavuligerus, Mit-1, foi isolada em Mithapur, na costa oeste da Índia. Esse microrganismo é Gram positivo e apresenta estrutura filamentosa na forma de longas cordas. A esporulação iniciou após dois dias de cultivo e o nível ótimo de produção de protease alcalina (130 U/ml) foi atingido no início da fase estacionária de crescimento. A cepa foi capaz de multiplicar com 0-10% NaCl (w/v), com um ótimo de 5% NaCl (w/v). O ótimo de crescimento e produção de protease foi atingido em pH 9, apresentando declínio substancial em pH neutro. Sacarose e gelatina foram as melhores fones de carbono e nitrogênio, respectivamente, enquanto o caldo gelatina foi o melhor meio para produção de protease. A cepa Mit-1 produziu bastante protease quando vários aminoácidos foram empregados como única fonte de nitrogênio. Substratos crus, como melaço, soro de leite e farinha de trigo, tiveram um efeito significativo na produção da enzima. Os resultados são bastante interessantes, considerando que somente poucos actinomicetos, especialmente os halotolerantes, já foram explorados por seu potencial de produção de enzimas e otimização de processos.
Resumo
The present study deals with the isolation and characterization of the moderately halophilic-alkaliphilic bacteria from a saline habitat in western India. Eight different bacterial strains were isolated using enrichment techniques at 20% (w/v) NaCl and pH 10. The isolates exhibited diversity towards gram's reaction, colony and cell morphology. They were able to grow and produce alkaline protease over a broad range of NaCl, 5-20% (w/v) and pH, 8-10. None of the isolates could grow at pH 7, and one could not grow even at pH 8. Crude and partially purified proteases from strain S5 were subjected to characterization with reference to pH, salt stability and protein folding. Optimum protease activity and stability was recorded at 10% salt and pH 9-9.5. Denaturation kinetics of S5 alkaline protease along with a reference protease was studied at 8M urea followed by renaturation. The S5 alkaline protease could be partially renatured up to 32% of the original activity. Despite of the fact that all the 8 isolates were from the same site, they displayed significant diversity with respect to their salt requirement for growth and enzyme secretion. While the effect of pH was less demarcated on growth, the protease production was significantly affected. Isolate S5 produced substantial amount of halotolerant and alkaline protease. The activity and stability of the alkaline protease in a broader range of pH and salt would definitely make this enzyme an important candidate for various industrial applications.
O presente estudo relata o isolamento e caracterização de bactérias moderadamente halofilicas e alcalífilicas de um habitat salino no oeste da Índia. Oito cepas diferentes de bactérias foram isoladas empregando técnicas de enriquecimento em NaCl a 20% (p/v) e pH 10. As cepas apresentaram diversidade em relação à coloração de Gram e à morfologia das colônias e células. As cepas foram capazes de multiplicar e produzir protease alcalina em uma ampla faixa de concentração de NaCl (5 a 20%) e pH (8 a 10). Nenhuma das cepas foi capaz de se multiplicar em pH 7, e uma não se multiplicou nem em pH 8.0. Proteases naturais e parcialmente purificadas da cepa S5 foram submetidas à caracterização com relação ao pH, estabilidade salina, e estrutura protéica. Atividade e estabilidade ótimas da protease foram obtidas com 10% de sal e pH 9-9,5. A cinética de denaturação da protease de S5, juntamente com uma protease de referencia, foi avaliada com uréia 8M seguida de renaturação. A protease alcalina de S5 foi renaturada a 32% da atividade original. Apesar de provenientes do mesmo local, as oito cepas mostraram grande diversidade em relação à exigência de sal para multiplicação e secreção enzimática. Enquanto o efeito do pH na multiplicação foi menos marcante, o efeito na produção de protease foi significativamente afetada. A cepa S5 produziu uma quantidade substancial de protease alcalina e halotolerante. A atividade e estabilidade da protease alcalina em uma faixa mais ampla de pH e sal tornam essa enzima uma importante candidata para diversas aplicações industriais.