Resumo
As doenças causadas pelas bactérias pertencentes ao gênero Clostridium estão entre as mais importantes enfermidades que causam efeitos deletérios e prejuízos aos produtores de rebanho de ovinos, caprinos e bovinos. Entre estas se destaca a enterotoxemia, causada pela toxina épsilon de Clostridium perfringens tipo D. Devido ao rápido curso dessa doença é preconizado a vacinação com a toxina épsilon inativada como o método mais indicado para a sua prevenção. Entretanto é reconhecida a baixa capacidade de manutenção dos anticorpos neutralizantes persistentes a partir das vacinas comerciais para a espécie caprina e pouca evidência do comportamento da duração da imunidade em bovinos. Com isso, o presente trabalho objetivou: (a) produzir, concentrar e purificar a toxina épsilon (ETX) de C. perfringens tipo D para a produção do seu respectivo toxoide na forma ultrafiltrada (EToX-U) e ultrafiltrada, dialisada e purificada em cromatografia de troca iônica (EToX-UC); (b) produzir vacinas utilizando os referidos toxoides em formulações do tipo microemulsão (ME), adsorvidos em micropartícula de quitosana (MQ), em nanopartículas de sílica mesosporosa (NSM), em nanopartículas de hidroxiapatita (HANP) e em hidróxido de alumínio (HA); (c)triagem das melhores formulações em imunizações de coelhos observando-se o título de anticorpos neutralizantes obtido pós vacinação segundo diretrizes da normativa oficial do MAPA com leitura da soroneutralização in vitro realizada em monocamada de células Madin Darby Canine Cells (MDCK); (d) avaliar as opções vacinais selecionadas em coelhos nas espécies alvos caprinos e bovinos por meio do acompanhamento da cinética da resposta humoral antitoxina épsilon nestas espécies pelo período de um ano. Além disso, avaliar o comportamento da curva de anticorpos em caprinos após a aplicação de uma terceira dose vacinal na semana 52 pós primovacinação. A produção da toxina épsilon de C. perfringens tipo D permitiu obter antígeno ETX-U e ETX-UC em qualidade e quantidade suficiente para as formulações pretendidas, bem como seus respectivos toxoides oriundos da inativação pelo formaldeído (EToX-U e EToX-UC). As vacinas formuladas à base de HA, MQ, NSM e HANP administradas em duas doses (t=0 e 21 dias) obtiveram títulos sorológicos médios superiores ou igual ao índice mínimo de aprovação de 2UI/mL na triagem inicial em coelhos, tornando-se opções viáveis de proteção imunológica frente à enterotoxemia causada pela toxina épsilon de C. perfringens tipo D. Por outro lado as vacinas à base de MQ, NSM e HANP administradas em dose única (t=0) não obtiveram títulos médios iguais ou acima do índice de aprovação, sugerindo que nas condições formuladas tais vacinas não seriam recomendados em esquema vacinal single shot. De forma similar, as vacinas em ME formuladas neste trabalho não lograram êxito na geração de título detectável nos coelhos, administrando-se tanto duas doses quanto dose única. Frente aos resultados obtidos em coelhos, as vacinas selecionadas para teste em espécie alvo foram: EToX-UC e EToX-U adsorvidos em hidróxido de alumínio e EToX-U adsorvido em micropartícula de quitosana cujos títulos médios de antitoxina épsilon em coelhos foram 10,24 UI/mL, 7,45 UI/mL e 6,03 UI/mL respectivamente. Quando avaliados nas espécies alvo, observou-se que os mais elevados títulos tanto no grupo de caprinos quanto bovinos foram aos 60 dias pós primovacinação, correspondendo a 10,5 UI/mL, 11,5 UI/mL e 6,9 UI/mL para as vacinas EToX-U HA, EToX-UC HA e EToX-UC MQ respectivamente em bovinos e 1,1 UI/mL, 3,9 UI/mL e 2,1 UI/mL para as vacinas EToX-U HA, EToX-UC HA e EToX-UC MQ respectivamente em caprinos. O estudo da concordância entre os títulos obtidos nos grupos animais neste experimento corrobora fortemente o fato do coelho representar um excelente modelo animal para a resposta em bovinos nas formulações à base de hidróxido de alumínio, 22 corroborando a indicação deste nos testes oficiais, porém com fraca concordância com caprinos para formulações com épsilon não purificado. O estudo de duração de imunidade com as formulações avaliadas em caprinos corroborou a necessidade de revacinação de três a quatro meses referendada por outros autores. Em relação aos bovinos, apesar de não existirem trabalhos na literatura que estabeleçam a duração de imunidade para a espécie, o resultado do título de antitoxina épsilon, apesar de limítrofe, conferiu proteção pelo período de um ano em acordo com as recomendações das vacinas comerciais de revacinação anual.
The diseases caused by bacterial belonging to the genus Clostridium are among the most important diseases that cause deleterious and loss effects to sheep, goat and cattle herds producers. Among these stand out the enterotoxemias, caused by Clostridium perfringens type D toxin. Because rapid course of this disease it is recommended vaccination with inactivated epsilon toxin as the most appropriate method for its prevention. However, the low maintenance capacity of persistent neutralizing antibodies from commercial vaccines in goat and the little evidence of the duration of immunity in cattle is recognized. The aim of the present work was to: (a) produce, concentrate and purify epsilon toxin (ETX) of C. perfringens type D for the production of its toxoid in the ultrafiltered form (EToX-U) and ultrafiltered, dialyzed and purified in chromatography (EToX-UC); (b) produce vaccines using toxoids in microemulsion (ME) -type formulations, adsorbed on microparticles of chitosan (MQ), mesosporous silica nanoparticles (NSM), hydroxyapatite nanoparticles (HANP) and aluminum hydroxide ); (c) screening the best formulations in rabbits by observing the titre of neutralizing antibodies obtained after vaccination according to guidelines of the official MAPA standard with in vitro seroneutralization readings performed on a monolayer of Madin Darby Canine Cells (MDCK) cells; (d) evaluate the selected vaccine options in rabbits in the caprine and bovine target species by monitoring the kinetics of the humoral epsilon antitoxin response in these species for a period of one year. In addition, to evaluate the antibody of profile curve in goats after the inoculation of a third vaccine dose at week 52 post-vaccination. The C. perfringens type D epsilon toxin production allowed to obtain ETX-U and ETX-UC antigen in sufficient quality and quantity for the desired formulations and their respective toxoids from inactivation by formalin (EToX-U and EToX-UC). The HA, MQ, NSM and HANP formulated vaccines administered at two doses (t = 0 and 21 days) produced high titers over 2UI/mL at initial screening in rabbits, making them viable options for immunological protection against enterotoxemia caused by the epsilon toxin of C. perfringens type D. On the other hand, MQ, NSM and HANP vaccines administered in a single dose (t = 0) did not obtain high titres suggesting that under formulated conditions such vaccines would not be recommended in a single shot vaccine scheme. Similarly, the ME vaccines formulated in this work did not succeed in generating detectable titer of antibodies in rabbits both when given two doses and a single dose. Based on the results obtained in rabbits, the best vaccines were: EToX-UC and EToX-U adsorbed on aluminum hydroxide and EToX-U adsorbed on microparticles of chitosan whose mean efficacy of epsilon antitoxin in rabbits was 10.24 IU / mL, 7.45 IU / mL and 6.03 IU / mL respectively. When evaluated in the livestock animals it was observed that the highest titers in both the goat and bovine groups were 60 days post-vaccination corresponding to 10.5 IU / mL, 11.5 IU / mL and 6.9 IU / mL for the the EToX-U HA, EToX-UC HA and EToX-UC MQ vaccines respectively in cattle and, 1.1 IU / mL, 3.9 IU / mL and 2.1 IU / mL for the EToX-U HA, EToX-UC HA and EToX-UC MQ respectively in goats. The study of the concordance between the titers obtained in the animal groups in this experiment corroborates strongly with the fact that rabbits represents an excellent animal model for the response bovines immune response in the formulations based on aluminum hydroxide corroborating with the indication of this one in the official tests, but with weak agreement with goats for formulations with unpurified epsilon. The study of duration of immunity with the formulations evaluated in goats showed the need of revaccination of three to four months as recommended by other authors. Regarding cattle, although there are no studies in the 24 literature that establish the duration of immunity for the species, the result of the epsilon antitoxin titer, although borderline, conferred protection for a period of one year