Novo gene cry8 de Bacillus thuringiensis: caracterização e avaliação da patogenicidade ao bicudo da cana-de-açúcar, Sphenophorus levis Vaurie, 1978 (Coleoptera: Curculionidae)

A caracterização molecular de 46 isolados de Bacillus thuringiensis foi realizada por meio da técnica de PCR com os oligonucleotídeos iniciadores gerais Gral-cry8(d)/Gral-cry8(r), resultando na identificação do isolado BT_I622 como portador do gene cry8 (coleóptero-específico). O fragmento obtido de aproximadamente 376 pares de base (pb), localizado na porção inicial do gene, foi clonado em vetor pGEM®-T Easy, sequenciado e analisado por bioinformática. A determinação da sequência completa do gene cry8 presente no isolado BT_I622, foi realizada pela estratégia de ?primer walking? com a utilização de oligonucleotídeos específicos. Os iniciadores foram elaborados através do programa Primer3, com base nas sequências de genes cry8 depositadas no banco de dados público GenBank (NCBI) e, por meio da análise das sequências geradas com o par de oligonucleotídeos gerais utilizados inicialmente na caracterização dos isolados. As amplificações com diferentes combinações de iniciadores resultaram na obtenção de fragmentos em torno de 1420, 3302, 628, 1580, 508 e 510 pb, os quais foram clonados, sequenciados e analisados pelos programas Phred/Phrap/Consed visando a montagem do gene. A sequência contendo 3531 pb foi comparada ao GenBank pela ferramenta BLASTn, apresentando 98% de similaridade com o gene cry8Ka2. Paralelamente, a sequência de aminoácidos deduzida (1176 aa) revelou 75% de identidade com a proteína Cry8Ba1 na análise com o algoritmo BLASTp, demonstrando que o isolado BT_I622 é portador de um novo gene cry8. Os bioensaios indicaram que as larvas de Sphenophorus levis são sensíveis a nova proteína Cry8 de B. thuringiensis

The molecular characterization of 46 Bacillus thuringiensis isolates was carried out using the PCR technique with primers designed to detect cry8 genes (Gral-cry8(d)/Gral-cry8(r)), resulting in the identification of the isolate BT_1622 as a cry8 gene carrier (coleopteran specific). The ca. 376 base pairs (bp) fragment obtained was located in the initial part of the gene, which was cloned into the plasmid pGEM®-T Easy, sequenced and analyzed by bioinformatics. The complete sequence determination of this gene found within isolate BT_1622 was done using the ?primer walking? strategy. The primers were designed using the software Primer3, comparing to previously sequenced cry8 genes found in the public database GenBank (NCBI) and analyzing the sequences generated with the pair of general primers used initially in the characterization of isolates. The amplifications with different primer combinations resulted other fragments of this gene with 1,420; 3,302; 628; 1,580; 508 and 510 bp, which were cloned, sequenced and analyzed using the software Phred/Phrap/Consed to obtain the full gene. The 3,531 bp sequence was compared to the GenBank using the BLASTn tool, and showed 98% of similarity with the gene cry8Ka2. Also, the deduced amino acid sequence (1,176 amino acids) showed 75% identity to the Cry8Ba1 using the algorithm BLASTp, demonstrating that the isolate BT_1622 carriers a new cry8 gene. The bioassay results indicated that the Sphenophorus levis larvae are sensitive to the new Cry8 protein of B. thuringiensis

Bacillus thuringiensis var. israelensis SPS1 : caracterização da região promotora de genes cry e efeito em larvas de Aedes aegypti (L.) (Diptera: Culicidae)

Dentre os microrganismos empregados no controle de mosquitos, a bactéria Bacillus thuringiensis var. israelensis (Bti) se destaca por apresentar atividade tóxica contra insetos da ordem Diptera, na qual produz inclusões cristalinas compostas pelas proteínas Cry, que são codificadas por genes cry presentes em um único plasmídeo. A produção dessas proteínas em grande escala está relacionada a mecanismos transcricionais, como por exemplo, a expressão de um gene sob o controle de um promotor forte. Tendo em vista que a bactéria Bti SPS1 (Patente PI0200228-0) foi isolada do território brasileiro e que possui potencial para o controle de vetores por produzir uma maior quantidade de esporos/cristais em menor tempo, este trabalho teve por finalidade a caracterização da região promotora dos genes cry4Aa, cry4Ba e cry11Aa de Bti SPS1 pelas técnicas de PCR e ?Southern blotting?. Em associação a estas técnicas, foi realizado bioensaio para a verificação da mortalidade de larvas de Aedes aegypti. Os resultados das análises moleculares indicaram homologia no perfil de hibridização da região promotora da linhagem padrão Bti T14-001 e do isolado Bti SPS1. A quantificação das suspensões em espectrofotômetro (DO600nm) e a leitura de esporos em câmara de Neubauer, revelaram que o isolado Bti SPS1 produz uma maior quantidade de esporos/cristais em relação à linhagem padrão Bti T14-001. O bioensaio apresentou elevados índices de mortalidade. Estes resultados tornam a bactéria Bti SPS1 uma fonte promissora para novas formulações visando o controle de vetores

Among the microorganisms used for mosquitoes? control the bacterium Bacillus thuringiensis var. israelensis (Bti) is frequently considered since it presents toxic activities? against Diptera, producing crystal inclusions including Cry proteins, which are coded by a sole plasmid borne set of genes. The production of these proteins in large scale is related to transcriptional mechanisms, as an example, a particular gene expression controlled by a strong promoter. Since the Bti bacterial isolate SPS1 (Patent PI0200228-0) was isolated within the Brazilian territory and exhibits potential for the control of vector insects due to a higher crystal production ability in shorter time period, this work had as objective the characterization of the promotion region for the genes cry4Aa, cry4Ba e cry11Aa using PCR and ?Southern blotting? techniques. Also some bioassays using Aedes aegypti larvae were carried out. The results from the molecular analysis have indicated homology for the hybridization profile from the promoter region from the type strain of Bti T14-001 and that of the SPS1 isolate. Spectrofotometric (OD600nm) and Neubauer chamber measures have revealed that the SPS1 isolate produces a higher amount of spore/crystal as compared to the Bti T14-001 strain. The bioassay presented higher mortality levels. These results seem to indicate that the isolate SPS1 is a promising bacterial strain to be used on formulations able to control insect vector pests